好食脉孢霉纤溶酶的纯化及体外纤溶活性研究

邓永平，车 鑫，艾瑞波，刘晓兰*，郭建华

1齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院；2黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，齐齐哈尔 161006

血栓栓塞性疾病严重危害人类生命和健康，溶栓疗法是主要的临床治疗手段[1]。目前临床使用的链激酶、尿激酶等药物虽然具有显著的溶栓疗效，但是半衰期短、副作用较大[2]。研究表明，纳豆激酶、蚓激酶等纤溶酶能够直接作用于血栓成分-血纤维蛋白，可以迅速、完全的溶解血纤维蛋白，且不会增加内出血等风险[3]。因此，从植物、动物和微生物中寻找纤溶活力更高、专一性更强、成本更低的纤溶酶成为目前的研究热点[4-6]。微生物生长周期短、代谢产物多样、易于大规模培养，是开发新型纤溶酶的主要来源。目前，已从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[6]、假单胞菌(Pseudomonas)[7]、短炭角菌(Xylariacurta)[8]、曲霉菌(Aspergillus)[9,10]、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)[11]等微生物中获得了纤溶酶。

纤溶酶作为功能食品或药品原料，其来源的安全性至关重要。来源于安全性细菌(如枯草芽孢杆菌)的纤溶酶，如纳豆激酶等已有大量的报道[6,12]。但是，来源于安全性霉菌的纤溶酶还很少见。好食脉孢霉是FDA组织认证的安全性(GRAS)真菌，在印度尼西亚、巴西和婆罗洲生活的居民食用好食脉孢霉发酵食品已有悠久历史[13,14]。本文使用的好食脉孢霉分离自发酵豆制品，前期研究中发现在其固体发酵豆渣基质的胞外代谢产物中含有较高活力的纤溶酶，与现有一些报道相比，好食脉孢霉产纤溶酶周期较短，酶活力较高，生产成本较低，具有开发为溶栓药物的潜力[9-11]。酶的分离纯化和功能性质研究是合理开发纤溶酶的基础，本文介绍了好食脉孢霉纤溶酶的分离纯化方法和体外纤溶活性，希望通过本文的研究可以为该纤溶酶在溶栓药物研制中的应用提供部分依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

好食脉孢霉(Neurosporasitophila)，分离自发酵豆制品，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC No.1836。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 主要实验仪器

层析柱26/20、层析柱26/40(GE Life Sciences)；Millicup抽滤装置(Millipore)；CF15RXII高速冷冻离心机(Hitachi)；AKTAPrime Plus蛋白质纯化系统(GE Life Sciences)。

1.2.2 主要实验试剂

人血纤维蛋白原、十二烷基硫酸钠、琼脂糖、牛纤维蛋白原、尿激酶、凝胶过滤低分子量标准品(Sigma公司)；凝血酶(天津血液制品研究所)；Octyl Sepharose FF、Sephadex G-25、CM-Sepharose HP、SP-Sepharose HP(GE Life Sciences)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)低分子量标准蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、苯基甲烷磺酰氟(PMSF)、抑肽酶(aprotinin)、胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)和赖氨酸(生工生物工程(上海)股份有限公司)；其余试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 好食脉孢霉纤溶酶粗酶液的制备

固体发酵：培养基由豆渣和麸皮组成，比例为4∶1，添加麸皮量7%(V/W)的CaCl2溶液(浓度为0.75%，W/V)和 FeSO4·7H2O溶液(浓度为0.045%，W/V)，料水比例为1∶4，pH自然。采用规格为30 cm×20 cm×3.5 cm的浅盘进行发酵，接种量为2×104个孢子/克干基，28 ℃恒温培养48 h。

粗酶液的制备：利用生理盐水浸提发酵产物2 h，在4 ℃、6 000 rpm离心15 min后收集上清液，通过40%～80%(W/V)饱和度的硫酸铵分级盐析后，在4 ℃、10 000 rpm离心20 min分离沉淀，经0.02 mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)复溶沉淀后得到粗酶液。

1.4 纤溶酶的分离纯化

1.4.1 Octyl-Sepharose FF疏水相互作用层析

将粗酶液的硫酸铵饱和度调至40%(W/V)进行疏水相互作用层析。平衡缓冲液：含40%(W/V)饱和度硫酸铵的0.02 mol/LpH7.4PBS；洗脱缓冲液：依次为含40%、20%、0%(W/V)饱和度硫酸铵的平衡液；流速：2.0 mL/min；上样量：50 mL；蛋白质浓度：5.23 mg/mL；洗脱方式：步阶式洗脱。收集纤溶活性组分进行下一步分离。

1.4.2 Sephadex G-25 凝胶过滤层析

利用Sephadex G-25凝胶过滤层析对Octyl-Sepharose FF收集的活性组分脱盐和更换缓冲液。蛋白浓度：0.272 mg/mL；洗脱缓冲液：0.02 mol/LpH6.0PBS；流速：2.0 mL/min；上样量：35 mL。收集纤溶活性组分进行下一步层析。

1.4.3 CM-Sepharose FF弱阳离子交换层析

利用CM-Sepharose FF弱阳离子交换层析进一步纯化纤溶活性组分。平衡缓冲液：0.02 mol/LpH6.0PBS；洗脱液：含0.5 mol/L NaCl的平衡缓冲液。上样量：55 mL；蛋白浓度：0.252 mg/mL；流速：2.0 mL/min。收集纤溶活性组分进行下一步层析。

1.4.4 SP-Sepharose HP 强阳离子交换层析

利用Sephadex G-25凝胶过滤层析对经CM-Sepharose FF弱阳离子交换层析纯化的纤溶酶组分进行脱盐和更换缓冲液，收集活性组分进行SP-Sepharose HP 强阳离子交换层析。平衡缓冲液：0.02 mol/LpH6.0PBS；洗脱液：含0.5 mol/L NaCl的平衡缓冲液。上样量：50 mL；蛋白浓度：0.09 mg/mL；流速：2.0 mL/min。收集纤溶活性组分。

1.5 纤溶酶纯度及分子量的鉴定

利用SDS-PAGE检验纤溶酶的纯度，分离胶浓度为12%(W/V)。采用SDS-PAGE和凝胶过滤法鉴定纤溶酶的分子量。凝胶过滤色谱柱为Superdex75 16/60预装柱，洗脱液：含0.3 mol/L的NaCl的0.02 mol/LpH7.4PBS；流速：0.5 mL/min。分离标准品后绘制标准曲线，得到方程：y=-0.406 8x+ 14.95(y代表分子量对数，x代表洗脱体积)，R2=0.9 884。

1.6 纤溶酶的体外纤溶活性研究

1.6.1 各种蛋白酶抑制剂对纤溶酶活力的影响

将1 mmol/L 的抑肽素(pepstatin)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶(aprotinine)、甲苯磺酰氨基苯乙基氯甲基酮(TPCK)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、Lys溶液与纤溶酶等体积混合，其中EDTA、PMSF、aprotinine、SBTI和Lys用双蒸水配制，pepstatin用甲醇配制(已做实验证明甲醇对酶活有轻微抑制作用)，TPCK用DMSO配制(已做实验证明DMSO对酶活无影响)，37 ℃分别水浴15 min和30 min，以双蒸水和甲醇(是pepstatin的对照)作为对照，测残余酶活。

1.6.2 纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解

根据Liu等的方法检测纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解情况，略有改进[8]。SDS-PAGE分离胶浓度12%(W/V)，将2%(W/V)人血纤维蛋白原(溶于0.05 mol/LpH7.6Tris-HCl缓冲液)200 μL与20 μL2.7 mg/mL的酶液(7.625 U/mL)混匀，在37 ℃保温5 min、45 min、1 h、2 h、6 h、9 h和24 h后进行SDS-PAGE，以还原的人血纤维蛋原作对照，确定纤溶酶对人血纤维蛋白原各亚基的降解情况。

1.6.3 纤溶酶激活纤溶酶原的分析

通过血纤维蛋白平板法研究纯化的纤溶酶降解血纤维蛋白的方式[11]。将血纤维蛋白平板在85 ℃加热30 min，得到无纤溶酶原平板，以未经处理的平板为对照，将纤溶酶液点加至两种平板上，在37 ℃保温2、4、6、9、12 h后测定溶圈面积，计算纤溶活力。

1.6.4 纤溶酶对人血清白蛋白的降解

采用SDS-PAGE检测纤溶酶对人血清白蛋白的降解情况，分离胶浓度12%(W/V)。将200 μL 2%(W/V)的人血清白蛋白(溶于0.05 mol/LpH 7.6Tris-HCl 缓冲液)与20 μL 2.7 mg/mL的酶液(7.625 U/mL)混匀，在37 ℃分别保温30 min、2 h、6 h和12 h，定时取样进行SDS-PAGE，以还原的人血清白蛋白为对照，确定纤溶酶对人血清白蛋白的降解情况。

1.7 纤溶酶活力的测定

纤溶酶活力的测定采用血纤维蛋白平板法[11]。血纤维蛋白平板制备方法(以配制10个平板为例)：将0.25 g琼脂糖溶于50 mL生理盐水，置于45 ℃水浴中保温30 min后加200 U的凝血酶混匀；0.2 g牛血纤维蛋白原溶于巴比妥钠-盐酸缓冲液(pH7.8)，置45 ℃水浴中保温5 min。分别取5 mL凝血酶溶液和5 mL牛血纤维蛋白原溶液迅速混合倒平板，冷却后4 ℃保存备用。纤溶酶活力测定：将10 μL样品溶液点加在血纤蛋白平板表面，37 ℃保温6 h。使用尿激酶作为标准，通过测量平板表面的透明区域面积定量酶的活性。

1.8 蛋白质浓度的测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白，根据参考文献[11]的方法测蛋白质浓度。

2 结果与讨论

2.1 纤溶酶的分离纯化

好食脉孢霉纤溶酶粗酶液经Octyl-Sepharose FF疏水相互作用层析分离后得到三个活性组分(图1)，其中活性峰组分2的蛋白吸收峰与纤溶活性峰对应，收集峰2进行脱盐和更换缓冲液，然后依次经过CM-Sepharose FF 弱阳离子交换层析(图2)和SP-Sepharose HP 强阳离子交换层析(图3)分离，最终得到单一的色谱洗脱峰，经过上述步骤纯化后，纤溶酶活性回收率为3.05%，比活力为519.59 U/mg，纯化倍数为86.60倍(表1)。虽然该分离路线使纤溶酶的纯度得到了较大程度提高，但是与短炭角菌(Xylariacurta)[8]、拟青霉(Paecilomycestenuipes)[15]等真菌纤溶酶的纯化路线相比，活性回收率偏低，因此该路线还有进一步优化的空间。

图1 Octyl-Sepharose FF 疏水相互作用层析洗脱曲线Fig.1 Elution profile of Octyl-Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography

图2 CM-Sepharose FF离子交换层析洗脱曲线Fig.2 Elution profile of CM-Sepharose FF ion exchange chromatography

表1 好食脉孢霉纤溶酶纯化步骤总结Table 1 Summary of purification steps of fibrinolytic enzyme from Neurospora sitophila

图3 SP-Sepharose HP离子交换层析洗脱曲线Fig.3 Elution profile of SP-Sepharose HP ion exchange chromatography

2.2 纤溶酶的纯度鉴定及分子量测定

利用SDS-PAGE检验了纯化后纤溶酶的纯度，结果见图4。好食脉孢霉纤溶酶经过纯化后在电泳图谱中显示两条带，推测该酶可能是由两个亚基组成。

图4 利用SDS-PAGE测定纤溶酶分子量Fig.4 Determination of the molecular weight of the fibrinolytic enzyme using SDS-PAGE注：泳道1为纯化后的纤溶酶，泳道Marker是标准分子量标记。Note:Lane 1:purified enzyme;Lane Marker:molecular mass markers.

采用SDS-PAGE和凝胶过滤法检测了纤溶酶的分子量。如图4所示，纯化后的纤溶酶样品经SDS-PAGE后在电泳图谱中显示有两个组分，分子量分别为30.0 kDa和15.5 kDa。经Superdex 75凝胶过滤分离后的洗脱体积为10.19 mL，经计算分子量约为49.2 kDa。两种检测方法得到的纤溶酶分子量略有差异，可能是因为纤溶酶分子形状非球形导致凝胶过滤法测得的分子量偏大，但是，根据凝胶过滤法测得的结果可以判断该酶由两个亚基组成。

综合SDS-PAGE和凝胶过滤法可确定该纤溶酶由2个亚基组成，分子量分别为30.0 kDa和15.5 kDa。不同微生物来源的纤溶酶分子量跨度较大，裂褶菌(Schizophyllumcommune)KCTC 6482纤溶酶的分子量只有17 kDa[16]；假单胞菌(Pseudomonasbaetica)SUHU25纤溶酶与本文纤溶酶分子量相似，约为42 kDa[7]；而分离自绣球菌(Sparassiscrispa)Wulf.ex.Fr.的纤溶酶分子量高达90 kDa[17]。但是，由两个亚基组成的纤溶酶分子的报道还很少见。

图5 不同抑制剂对纤溶酶活力的影响Fig.5 Effect of different inhibitors on the fibrinolytic activity of purified enzyme from Neurospora sitophila注：抑制剂1～9分别是EDTA、Lys、TPCK、SBTI、PMSF、aprotinine、ppstatin、双蒸水和甲醇。Note:Inhibitors1-9 are EDTA,Lys,TPCK,SBTI,PMSF,aprotinine,pepstatin,ddH2O and methanol,respectively.

2.3 脉孢霉纤溶酶的纤溶性质

2.3.1 蛋白酶抑制剂对纤溶酶的影响

将1 mmol/L的七种蛋白酶抑制剂与纯化后的纤溶酶共同保存15 min和30 min后测定纤溶酶活力，结果见图5。

如图5所示，PMSF对纤溶酶的活性有显著抑制作用，丝氨酸蛋白酶抑制剂SBTI、Lys和胰凝乳蛋白酶抑制剂TPCK与酶共存30 min时也对酶活力表现出抑制作用，说明好食脉孢霉纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，有与胰凝乳蛋白酶、丝氨酸蛋白酶相似的活性中心。已见报道的多数纤溶酶都属于丝氨酸蛋白酶，例如米曲霉纤溶酶[10]、纳豆激酶[12]等。1 mmol/L的金属蛋白酶抑制剂EDTA不抑制纤溶酶活性，说明该酶活性中心不含金属结合位点，这与蛹虫草(Cordycepsmilitaris)[11]、海洋链霉菌(Streptomycessp.)MY0504[18]的纤溶酶相似，但是与裂褶菌(Schizophyllumcommune)KCTC 6482[16]、特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)[19]产的纤溶酶完全相反。

2.3.2 纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解

利用SDS-PAGE检测纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解。人血纤维蛋白原在凝血酶的作用下可以凝聚为血纤维蛋白，而血纤维蛋白是构成血栓的主要组分[1]，因此，检测纯化的纤溶酶在体外对人血纤维蛋白原的降解情况可以说明纤溶酶的溶栓潜力。纤溶酶与人血纤维蛋白原不同保存时间的样品的SDS-PAGE图谱见图6。

图6 利用SDS-PAGE分析纤溶酶降解人血纤维蛋白原情况Fig.6 Analysis of reduced human fibrinogen after digestion by the purified enzyme by SDS-PAGE注：泳道C是对照；泳道1～7分别为纤溶酶降解人血纤维蛋白5 min、45 min、1 h、2 h、6 h、9h和24 h的样品。Note:Lane C:Control;Lanes 1-7:Degradation pattern of fibrinogen at different time intervals of 5 min,45 min,1 h,2 h,6 h,9h and 24 h,respectively.

如图6所示，与好食脉孢霉纤溶酶共存5 min时，人血纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ三条肽链均有不同程度的降解，当共存45 min时Aα和Bβ链已经完全降解，当共存6 h时γ链完全降解。人血纤维蛋白原的Aα链C末端结构相对松散，易于被外源纤溶酶降解，例如PTEFP纤溶酶只能水解人血纤维蛋白原的Aα链，不能水解Bβ和γ链[3,15]。好食脉孢霉纤溶酶能完全降解人血纤维蛋白原的三个亚基，作用方式与蛹虫草(Cordycepsmilitaris)纤溶酶相似[11]。

2.3.3 纤溶酶激活纤溶酶原的分析

市售的牛血纤维蛋白原中含有残余的纤溶酶原，因此配制的血纤维蛋白平板中含有纤溶酶原，将配制好的血纤维蛋白平板在85 ℃下保温30 min，钝化纤溶酶原，经过这样处理的平板称为阴性平板，不经过此处理的平板称为阳性平板[11]。平板法测定好食脉孢霉纤溶酶作用方式的结果见图7。

图7 纯化的纤溶酶激活纤溶酶原的分析(n =3)Fig.7 Analysis of plasminogen activation by the purified fibrinolytic enzyme(n =3)注：同组列中带有不同上标的值存在显著差异(P<0.05)。Note:Values with the different superscript within the column of same group are significantly different (P<0.05).

如图7所示，在保温不同时间时，好食脉孢霉纤溶酶在阳性平板上测得的酶活力显著大于阴性平板(P<0.05)，说明好食脉孢霉纤溶酶不仅可以直接降解血纤维蛋白，还具有激活纤溶酶原间接促进血纤维蛋白降解的功能。报道表明，不同来源的纤溶酶可能具有不同的纤溶方式，一些纤溶酶直接降解血纤维蛋白[17]，还有一些纤溶酶具有激活纤溶酶原的功能[16]，但是，也有少数纤溶酶与好食脉孢霉纤溶酶相似，兼具上述两种功能，如蛹虫草纤溶酶、纳豆激酶[11,12]。

2.3.4 纤溶酶对人血清白蛋白的降解

人血清白蛋白是血浆的主要组成成分，在机体中执行多种生理功能，例如控制渗透压、转运生物分子等[20]。利用SDS-PAGE检测好食脉孢霉纤溶酶对人血清白蛋白的降解情况，结果见图8。

如图8所示，好食脉孢霉纤溶酶与人血清白蛋白共存12 h范围内未降解人血清白蛋白。这与蛹虫草(Cordycepsmilitaris)纤溶酶不同，蛹虫草纤溶酶与人血清白蛋白共存4 h时即对其产生了降解[11]。好食脉孢霉纤溶酶不降解人血清白蛋白，并且由图5和图6可知，该酶具有降解人血纤维蛋白原和激活纤溶酶原的双重功能，与已开发为药品的纳豆激酶、蚓激酶溶解血纤维蛋白的方式相似，因此，极具有开发为溶栓药物的潜力[3]。

图8 纤溶酶对人血清白蛋白的影响Fig.8 Effect of purified enzyme on human serum albumin注：泳道C是人血清白蛋白对照；泳道1～4分别为纤溶酶降解人血清白蛋白30 min、2 h、6 h和12 h的样品。Note:Lane C:Control of HSA;Lanes 1-4:Degradation pattern of human serum albumin at different time intervals of 30 min,2 h,6 h and 12 h,respectively.

3 结论

采用多种层析模式相结合的纯化方式从公认安全菌株好食脉孢霉(Neosporasitophila)的胞外代谢产物中纯化了一种纤溶酶，纯化倍数为86.6倍，比活力为519.59 U/mg。该酶是一种丝氨酸蛋白酶，能顺次降解人血纤维蛋白原的Aα、Bβ和γ链。该酶不仅可以直接溶解血纤维蛋白，还可以作为纤溶酶原激活剂。此外，该酶不降解人血清白蛋白。上述结果表明，好食脉孢霉纤溶酶具有开发为预防血栓形成和治疗血栓疾病的药物的潜力。