早期肝癌热消融术后复发的机制研究进展

杨健筌，郭文综述，卢漫审校

611731成都，电子科技大学 医学院(杨健筌)；637199四川 南充，川北医学院 药学院(郭文)；610041成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心,电子科技大学医学院 超声医学中心(卢漫)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率位居恶性肿瘤的第4位，死亡率第2位[1-2]。因此，要提高肝癌患者的生存率，早诊、早治是重要的方式。早期肝癌的根治性治疗方式有活体肝移植、肝切除术及局部消融治疗。活体肝移植存在供体肝源有限、术后易发生免疫排斥等问题[2]；肝癌切除术患者的肝功能需要Child-Pugh A级，而我国多数肝癌患者有乙肝、肝硬化的病史，常伴有肝脏储备功能差，行肝癌切除术的风险高[3]；局部消融治疗具有微创、对肝功能影响小，使不能手术的患者获得了根治性治疗的机会[4]。同时，在外科手术与局部消融治疗的对比研究中，二者的总生存期(overall survival，OS)无差异[5]。但有研究显示，相比外科手术，局部消融治疗具有更高的局部复发率(local recurrence，LR)[6]，机制仍不清楚，但针对它的机制研究逐渐增多。笔者将分别阐述肝癌常用的消融治疗手段和热消融术后LR的机制研究进展。

1 常用的局部消融治疗方式

1.1 射频消融(radiofrequency ablation，RFA)

RFA是利用射频交流电在经皮放置的探头和周围组织之间产生热量，温度在60℃～100℃之间维持5～10 min，使肿瘤和周围组织发生凝固性坏死[7]。对于不能耐受手术的早期肝癌患者，研究表明RFA可获得根治性的疗效，推荐用于不适合手术的早期肝癌的一线治疗[8]。然而，RFA存在热沉降效应(heat-sink effect，HSE)，即流动的血液或空气会吸收消融区温度，从而降低RFA的疗效。因此，当肿瘤邻近血管时，RFA疗效会受到影响,并且RFA还可能导致皮肤烧灼[9]。

1.2 微波消融(microwave ablation，MWA)

MWA通过放置在肿瘤内的天线产生900～2 500 MHz的电磁场，磁场主要作用于水分子使其动能增加，从而提高了组织的温度[10]。与RFA相比，MWA具有更低的HSE，皮肤烧灼伤的发生率更低，而消融范围更大[11]。有研究显示[12]，对于5～7 cm的肝癌，MWA的完全消融率可达80%，而RFA只有24%。

1.3 冷冻消融(cryoablation，CA)

CA是借助液氮或低温探头末端快速减压的氩气使温度维持在-20°C～-40°C之间，细胞内形成冰，导致细胞死亡[13]。由于CA与热消融的原理不同，消融时形成冰球消融区，可通过CT、MRI及超声等影像设备实时监测消融区的范围和大小[14]。但CA约有1%的低温休克发生率，甚至是致死性的，而且CA在肝癌中的长期疗效有待进一步研究[15]。

1.4 不可逆电穿孔(irreversible electroporation，IRE)

IRE是通过消融探针上产生非热电场，破坏附近的组织细胞膜，改变离子驱动稳态，导致细胞死亡[16]。IRE的优点是可保护消融区周围的胆管、血管等免受损害[17]，但IRE作为一种新的消融治疗手段，其适用病种及长期疗效的资料有限，需进一步研究[18]。

虽然局部消融的方式较多，针对早期肝癌根治性消融术多采用RFA和MWA两种热消融方式，笔者也将针对热消融导致的肝癌复发的机制进行探讨。

2 肝癌热消融术后复发的机制

2.1 上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)

EMT是指上皮细胞向间质细胞转换，分子发生重塑，表型发生改变，使上皮来源的肿瘤细胞侵袭、转移的能力增强，是肿瘤进展的表现。EMT的分子标志物改变包括上皮细胞标志物E-cadherin表达的缺失，间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin蛋白表达的上调，以及转录调控因子Snail、Slug、Twist等表达量的增加。为研究消融后残留肿瘤细胞是否发生EMT, Yoshida等[19]采用体外模拟热消融，即亚致死热应激(sublethal heat stress，SHS)，将肿瘤细胞置于水浴中，温度分别为45℃和55℃，时间10 min，存活下来的肿瘤细胞在第5 d时细胞形态发生纺锤样改变，CD133、CK7、CK19和 Snail蛋白表达增加，在第12 d又恢复到基线水平，表明经SHS后存活的肿瘤细胞发生了EMT，并且激活ERK1/2信号通路，抑制ERK1/2信号通路后，可抑制肿瘤细胞的增殖。Dong等[20]发现SHS处理后的肿瘤通过AKT和ERK信号通路促进肝癌细胞PCNA、N-cadherin和MMP-2、MMP-9的表达而发生EMT，进一步的动物实验发现肺转移的风险增加。有研究通过分析消融术后复发患者标本与未行消融术的肝癌患者标本，发现EMT相关标志物TGF-β、Twist、Snail-1在消融后复发患者中增加，作者认为，EMT的发生可能与复发患者的miR-200c、miR-34a表达量降低相关[21]。为进一步确定复发肿瘤发生的EMT改变，有学者在小鼠原位肿瘤模型上采用肿瘤消融不全方式(即非等中心消融)，发现E-cadherin下调、N-cadherin和Vimentin上调，表明β-catenin是这一过程中的关键因子，阻断β-catenin可以减少肿瘤细胞EMT表型的改变和转移[22]。Fettillins作为EMT调控蛋白，研究显示，SHS处理后残留肝癌细胞使Fettillins表达增加，进一步激活AKT/Wnt/β-catenin信号通路使残留细胞发生EMT，侵袭能力增强[23]。EMT作为肿瘤细胞获得更强侵袭和转移能力的关键步骤，已在肝癌热消融术后的细胞、动物模型及人体组织标本中得到了证实。因此，发现导致EMT的关键蛋白及重要的信号通路将为今后更深入地研究和防治提供方向和基础。

2.2 通过HIF-1α /VEGF信号通路促进血管生成

HIF-1α作为重要的低氧适应性反应的调节因子，在低氧条件下高表达，在常氧条件下维持低浓度。HIF-1α通常在侵袭性肿瘤中表达增加，可作为肝癌预后不良的独立预测因子[24]。HIF-1α在肿瘤生长、血管生成、侵袭和转移中具有重要作用，可直接促进大量的血管生成相关基因表达上调，如血管表皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。VEGF家族是一类结构相关的分子，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD，在多种人类肿瘤中高表达。Kong等[25]通过比较经SHS处理后的肿瘤细胞与亲本细胞，发现HIF-1α 与VEGF表达量增加，血管生成效应增强，而使用VEGF抗体贝伐单抗可消除该效应。Liu等[26]在细胞实验中发现经SHS处理的肿瘤细胞通过激活依赖于CaMKII/ERK的VEGF过表达促进肝癌细胞增殖。同样的 ，在移植瘤动物模型同样发现消融后残留肿瘤细胞的HIF-1α 、VEGF增加，微血管密度增加，在动物模型层面证实了消融后复发是通过HIF-1α /VEGF信号通路促进血管生成导致肿瘤侵袭、转移[27]。Tan等[28]在小鼠模型中发现，不完全消融导致肿瘤细胞高表达VEGF受体1，使肿瘤细胞血管生成效应增强，靶向作用于VEGF受体1可降低肿瘤细胞的增殖、迁移能力。通过肝癌消融复发患者的标本分析发现，与未行RFA的肝癌标本相比，消融复发患者HIF-1α表达量增加；生存分析显示，消融后复发患者OS低于未行RFA患者[29]。因此，一系列的研究结果证实了肝癌消融后复发的机制之一是通过激活HIF-1α /VEGF信号通路促进血管生成进而导致复发、转移，靶向VEGF可以抑制血管生成效应。

2.3 激活自噬

自噬是一种细胞的自我保护机制，可降解溶酶体中的细胞质、受损的细胞器和易于聚集的蛋白质等[30-31]。有研究表明,自噬在包括癌症在内的多种疾病中起着关键作用[32]。在肝癌中，LC3-II(一个关键的自噬标记物)的表达水平与肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)预后正相关[33]。研究发现，自噬可以使肝癌细胞在不利条件下存活、恶性进展、远处转移以及对化疗耐药，抑制自噬会降低肿瘤细胞的存活率[32-36]。Thompson等[37]发现SHS处理后的肝癌细胞激活了自噬重要信号通路PI3K/mTOR/AKT，导致肿瘤细胞增殖、侵袭能力增强。Jondal等[38]在细胞及动物实验中证实SHS处理后的肝癌细胞激活自噬关键通路PI3K/mTOR/AKT使肿瘤细胞侵袭性增强。而有研究者使用自噬抑制剂氯喹可以抑制SHS处理后残留的肿瘤细胞的生长[39]。Zhao等[40]首次采用在异位动物模型上使用不全性消融观察到残留肿瘤细胞发生自噬，增殖、侵袭能力增强，使用羟氯喹能显著抑制肿瘤的生长。自噬作为恶性肿瘤发生、发展的重要机制，在肝癌消融后复发中也会发生，在细胞及动物实验中发现，通过抑制自噬可以抑制肿瘤的进展。

2.4 非编码RNA

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)通常被定义为大于200个核苷酸，缺乏蛋白质编码功能的转录本。近年来lncRNA在癌症生物学中发挥了重要的调控作用，包括免疫应答、肿瘤发生、细胞发育和代谢[41]。基因芯片检测肝癌lncRNA表达，证实有数百个lncRNA在肝癌组织中异常表达[42]。研究发现[43]，经SHS处理的肝癌细胞全基因组中，有558个lncRNA和250个mRNA表达上调，224个lncRNA和1 031个mRNA表达下调。进一步研究发现，lncRNA FUNDC2P4在SHS处理后的肝癌中低表达，通过降低E-cadherin的表达促进EMT，从而促进肿瘤的增殖、侵袭。国内的廖云忠等[44]同样采用体外模拟不完全消融肝癌细胞，利用LncPathTM发现多个lncRNA表达量改变，进一步结合临床病例标本，认为残留的肝癌细胞通过降低EMT相关的LncRNA FOUNDC2P4促进EMT，增强肿瘤细胞的侵袭能力，最终导致肿瘤复发。非编码RNA作为当前生命科学的研究热点，在肝癌消融复发机制中的研究较少，需进一步揭示其作用。

2.5 肿瘤微环境改变

肿瘤微环境的改变在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用。在肝细胞癌的微环境中富含活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)。有证据表明，HCC与活化的HSC相互作用促进了HCC的成瘤性、生长、迁移、侵袭、血管生成和转移[45]。Periostin(POSTN)是活化HSC的关键蛋白之一，是较好的抗纤维化治疗靶点[46]，参与了癌细胞增殖和EMT等过程[47]。此外，间质表达POSTN与HCC高侵袭性相关[48]。Zhang等[49]将肝癌细胞暴露于SHS后，在活化的HSC条件培养液中(HSC-conditioned medium,HSC-CM)进行培养，HSC-CM通过分泌POSTN明显增强残留肝癌细胞的侵袭能力，使EMT增强,证明了POSTN在肝癌消融复发中的重要作用。研究者进一步发现POSTN通过激活整合素β-1/AKT/GSK3-β/β-catenin/TCF4/Nanog信号通路调节热消融后残留肝癌细胞的肿瘤干细胞特性[50]。Zhang等[51]还发现基质硬度增加参与了SHS处理后残留肝癌细胞恶性进展，同时，细胞外基质I型胶原也参与了SHS处理后残留肝癌细胞的增殖。肿瘤微环境在肿瘤发生、发展中具有重要作用，现有的文献对肿瘤微环境在肝癌消融复发中的作用及机制进行了初步研究，但需更深入地寻找重要信号通路及关键蛋白。

3 总 结

局部消融治疗作为一种微创、安全、有效的治疗手段，在早期肝癌治疗中具有重要的地位。对于肝癌热消融后复发机制的研究主要是集中在EMT、血管生成、自噬激活及肿瘤微环境改变等方面。多数研究是在细胞层面，部分是动物实验。对于体外建立肿瘤不全消融模型，多数是采用水浴加热肿瘤细胞，这种方式是否能完全模拟肿瘤所处的环境，有学者提出质疑[52]，并且不同实验的水浴时间与温度也不全相同，缺乏统一标准。而且肿瘤的不同复发时间是否其参与的机制也不同，这需进一步的研究。但现有的研究结果从多个层面探索了肝癌消融后复发的可能机制，未来希望能进一步完善细胞及动物模型，深入揭示其潜在的机制，为临床转化提供理论基础。

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