不同酵母对桑葚酒品质的影响及菌株筛选

孔燕，秦凡平，覃俊，龚馨，廖丽，姜林君，陈安均

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625000)

桑葚又名桑椹、桑枣等，为桑树所结的聚合型多肉浆果[1]。桑葚风味独特，营养丰富[2]，但鲜果在室温下极不耐贮藏，易变味、腐烂[3]。用桑葚酿造桑葚酒，可解决桑葚不耐贮藏的问题。桑葚酒是以新鲜桑葚或桑葚汁为原料，利用酵母将糖转化为酒精等产物得到的果酒产品[4]。

酿酒酵母是果酒酿造成败及品质好坏的一个关键因素[5]。OUYANG等[6]、刘玮等[7]研究了酵母种类对桑葚酒挥发性风味物质的影响；史清龙[8]、TAO等[3]研究了不同酵母对桑葚酒感官品质的影响；颜雪辉[9]对桑葚酒专用酵母进行了选育；TCHABO等[10]研究了酵母接种量对桑葚酒挥发性风味物质的影响；LIU等[11]研究了酵母菌株对桑葚酒抗氧化活性的影响；张晶等[4]研究了酵母接种量对桑葚酒中挥发酸的影响。但尚未开展酿制低挥发酸桑葚酒的菌株筛选研究。

本实验选择5株产挥发酸较低的商业酵母(AC、F33、F15、FX10和2323)和5株常见的商业酵母(RC212、D254、71B、KD和Top15)酿制桑葚酒，主要分析不同酵母对桑葚酒挥发酸的影响，并结合挥发性风味物质和感官评价，采用模糊综合评判模型，选出1株最适宜发酵桑葚酒的酵母。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚(云桑2号)，采摘自四川省盐边县；F15、F33、FX10、AC酵母，法国拉氟德公司；2323、D254、RC212、71B酵母，法国拉曼公司；Top15酵母，意大利英纳帝斯公司；KD酵母，法国马丁威兰特公司(酵母均为市售产品)。

焦亚硫酸钾(食品级)，一诺生物科技有限公司；葡萄糖等(分析纯)、乙酸正丁酯等(色谱纯)，成都市科隆化学品有限公司；叔戊醇(标准品)，上海易恩化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

1 μL微量进样器(W-3型)，上海安亭微量进样器厂；50/30UM DVB/CAR on PDMS萃取头、固相微萃取手动进样手柄，上海安谱实验科技股份有限公司；气相色谱仪(7890B型)、气相色谱-质谱联用仪(7890A/59750型)，美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 桑葚酒的酿制

桑葚清洗后压榨取汁，加80 mg/kg SO2，室温密封放置3 h，加蔗糖调整糖度为21 °Brix，按桑葚汁质量的0.03%添加酵母，20 ℃发酵，发酵结束后，倒灌除去酒脚，加40 mg/kg SO2， 20 ℃陈酿30 d。

1.3.2 基础指标的测定

酒精度按GB 5009.225—2016[16]的方法测定；干浸出物、总糖、还原糖、总酸、挥发酸，按GB/T 15038—2006[17]的方法测定；甲醇按GB 5009. 266—2016[18]的方法测定；可溶性固形物(total soluble solid，TSS)用手持糖度计测定；pH用酸度计测定。

1.3.3 挥发性风味物质的测定

参照XIAO等[19]、蒋成[20]的方法，采用顶空固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)结合气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)测定桑葚酒中的挥发性风味物质。

内标物配制和酒样处理：用体积分数为60%的乙醇配制含1 770 mg/L乙酸正丁酯的标准溶液，吸取50 μL标准溶液于10 mL容量瓶中，用酒样定容，得到含8.85 mg/L乙酸正丁酯的待测酒样。

挥发性风味物质萃取操作：向含1 g NaCl的顶空瓶中加4 mL待测酒样，把顶空瓶放入50 ℃恒温水浴锅中平衡10 min后，将固相微萃取头插入顶空瓶内萃取40 min，萃取完成后，再于GC进样口解析5 min。

GC条件：HP-5MS色谱柱30 m×0.250 mm，初始温度40 ℃，保持时间5 min，以10 ℃/min升至70 ℃，再以3 ℃/min升至140 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，载气为氦气，流速为1.2 mL/min，不分流，进样口温度260 ℃。

MS条件：电离方式EI，电离电压70 eV，灯丝流量0.25 mA，连接杆温度280 ℃，电子倍增器电压1 500 V，扫描范围30～350 mAU，离子源温度250 ℃。

定性分析：通过检索工作站自带的NIST11标准谱库定性，选择匹配度≥70%的物质为有效物质。

定量分析：采用内标法进行半定量分析，计算如公式(1)所示:

待测挥发性物质浓度

(1)

1.3.4 感官评价

参照GB/T 15038—2006[17]和胡永正[21]的方法，由四川农业大学食品学院18名具有专业知识的人员，对陈酿30 d后的桑葚酒进行感官评价，评价指标、标准及权重如表1所示。

表1 桑葚酒感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of mulberry wine

1.4 实验数理统计分析

实验结果表示为平均值±SD(n=3)，采用IBM SPSS Statistics 26软件对数据进行统计分析，采用origin 2018软件作图，相关性分析采用相关系数法，显著性界值为P<0.05，极显著性界值为P<0.01。

2 结果与分析

2.1 不同酵母对桑葚酒基础指标的影响

10株酵母发酵桑葚酒的基础指标如表2所示。不同酵母代谢存在差异[22]，发酵酒的指标也有所不同。D254和FX10发酵酒酒精度最高，为10.52 vol%和10.45 vol%，RC212和KD发酵酒酒精度最低，为9.46 vol%和9.75 vol%。RC212和KD发酵酒干浸出物含量和TSS最高。71B和Top15发酵酒总糖含量最高，为3.03和2.99 g/L，这2株菌发酵酒酒精度为10.03 vol%和10.06 vol%，除RC212和KD外，低于其他6株菌。Top15和F15发酵酒还原糖含量最高，为2.68和2.58 g/L。RC212和KD发酵酒总酸含量最高，为9.81和9.06 g/L，这2株菌发酵酒的pH值也最低，均为4.11。NY/T 1508—2017[23]规定，果酒中总酸质量浓度为4.00～9.00 g/L(以酒石酸计)，RC212和KD发酵酒总酸含量超过了限量标准。RC212、KD、Top15和71B发酵酒挥发酸含量最高，分别为1.94、1.86、1.45和1.42 g/L，高于GB 15037—2006[13]规定的挥发酸限量。10株菌发酵酒甲醇含量均小于国家限量标准400 mg/L[13]。

表2 不同酵母发酵桑葚酒的基础指标Table 2 Basic indexes of mulberry wine by different yeast strains fermented

2.2 不同酵母对桑葚酒挥发性风味物质的影响

RC212和KD发酵酒总酸和挥发酸含量、Top15和71B发酵酒挥发酸含量均不符合果酒限量标准，故这4株菌不适合酿制桑葚酒，不进行挥发性风味物质分析。

由表3可知，2323、AC、FX10、F15、D254和F33发酵酒中共检出44种挥发性风味物质，其中，酯类23种，醇类5种，醛类1种，酮类2种，酚类9种，其他类4种，种类排序为AC(29种)= F33(29种)>F15(28种)>2323(27种)>FX10(25种)=D254(25种)。6株菌发酵酒中挥发性风味物质质量浓度为46 167.98～70 302.36 μg/L，酯类24 859.03～33 102.50 μg/L，醇类18 603.67～38 459.34 μg/L，醛类192.39～357.99 μg/L，酮类0～32.57 μg/L，酚类1 919.33～2 925.15 μg/L，其他类464.44～2 198.39 μg/L，总量排序为2323(70 302.36 μg/L)>D254(66 509.25 μg/L)>F15(63 863.25 μg/L)>F33(58 677.77 μg/L)>FX10(51 294.19 μg/L)>AC(46 167.98 μg/L)。

2.2.1 酯类物质比较

酯类是发酵酒挥发性成分的重要组成部分，也是构成香气骨架的关键成分[24]，可赋予果酒浓郁的水果香[25]。2323、AC、FX10、F15、D254和F33发酵酒酯类含量分别为27 661.31、24 859.03、28 001.02、25 482.8、33 102.5和28 775.67 μg/L，占各自发酵酒挥发性风味物质总量的39.35%、53.84%、54.59%、39.90%、49.77%和49.04%，D254和F33发酵酒酯类含量最高，但AC和FX10占比最大。6株菌发酵酒中共有的酯类有11种。所有酯类中辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯含量较高，且6种酒样均有这4种物质。辛酸乙酯可赋予果酒花香、香蕉味、梨味和白兰地味[26]；丁二酸二乙酯具有苹果香，酒香和舒适的花香[27]；癸酸乙酯具有脂肪味，舒适的醋味和果香[28]；正己酸乙酯具有蜡香、脂肪香和青草香[27]。刘琦[25]研究了BV818、EC1118、LA-FR和SY 四种酵母对贵人香干白葡萄酒香气的影响，发现辛酸乙酯和正己酸乙酯含量在酯类中较高，与本研究相似。

表3 不同酵母发酵酒的挥发性风味物质Table 3 Volatile flavor compounds of mulberry wine by different yeast strains fermented

续表3

2.2.2 醇类物质比较

醇类主要是酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物[36]。2323、AC、FX10、F15、D254和F33发酵酒醇类质量浓度分别为38 459.34、18 603.67、18 726.34、35 085.71、29 051.53和27 025.58 μg/L，占各自发酵酒挥发性风味物质总量的54.71%、40.30%、36.51%、54.94%、43.68%和46.06%，2323和F15发酵酒醇类含量最高，占比也最大。苯甲醇、苯乙醇和芳樟醇是6个酒样中共有的醇类，这3种醇的含量也最高。苯甲醇有苦杏仁味[27]，苯乙醇有玫瑰花和蜂蜜香[26]，芳樟醇可赋予果酒花香、青草味和柑橘香[20]。香茅醇是AC、F15和F33发酵酒特有醇类；1-辛醇是AC、FX10和F33发酵酒特有醇类。孙玉霞等[37]研究了D254、EC1118、D21、K1、DV10和 BM4×4六种酵母对桑葚酒挥发性风味物质的影响，发现苯乙醇含量较高，与本研究相似，其还检出正丙醇、异丁醇、异戊醇和十二醇等，本研究未检出。

2.2.3 醛酮类、酚类及其他类比较

2323、AC、FX10、F15、D254和F33发酵酒中醛酮类、酚类及其他类物质的总质量浓度分别为4 181.71、2 705.28、4 566.83、3 295.14、4 355.22和2 876.52 μg/L，占各自发酵酒挥发性风味物质总量的5.95%、5.86%、8.90%、5.16%、6.55%和4.90%。6个酒样共有的物质为苯甲醛和甲氧基苯基肟，苯甲醛有特殊的杏仁气味[34]，甲氧基苯基肟的风味描述未见报道。2323、AC、D254和F33发酵酒中丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚和甲氧基苯基肟含量均较高，丁香酚有强烈的丁香香气和温和的辛香香气[35]，2,4-二叔丁基苯酚的风味描述也未见报道；FX10发酵酒中含量较高的是丁香酚和甲氧基苯基肟；F15发酵酒中含量较高的是2,4-二叔丁基苯酚和甲氧基苯基肟。

2.3 感官评价

6株菌发酵酒的感官得分情况如表4所示。不同酵母发酵酒外观、滋味和典型性差异均不显著(P<0.05)； 2323、AC、FX10、D254之间香气差异不显著，但与F15和F33差异显著(P<0.05)。综合得分为FX10>2323>F15>D254>AC>F33，2323、AC、FX10、F15和D254之间综合得分差异不显著，但与F33差异显著(P<0.05)。

表4 感官评价得分情况 单位:分

2.4 相关性分析

挥发性风味物质含量与桑葚酒感官得分的相关性如图1所示，挥发性风味物质含量与外观和典型性相关性不大；乙酸苄酯、乙基9-癸烯酸酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、DL-白氨酸乙酯、香茅醇、2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚、3-甲基-4-异丙基苯酚含量与香气相关性较大，其中，前4种物质与香气呈正相关，与后5种呈负相关，DL-白氨酸乙酯与香气呈显著负相关(P<0.05)，2,6-二叔丁基对甲酚与香气呈极显著负相关(P<0.01)。苯甲醇、3-苯丙酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、2,4-二叔丁基苯酚含量与滋味相关性较大，且呈正相关，与滋味呈负相关的挥发性风味物质矩阵颜色均较浅。月桂酸乙酯、癸酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚、3-甲基-4-异丙基苯酚、DL-白氨酸乙酯含量与感官综合得分相关性较大，其中，前4种物质与感官综合得分呈正相关，后3种呈负相关。

图1 挥发性风味物质与感官得分的相关性热图Fig.1 The heat map of correlation of volatile flavor substances and sensory evaluation scores注：矩阵中红色、蓝色和白色分别代表正相关、负相关和不相关，颜色越深相关性越大。“*”表示相关性显著(P<0.05)；“**”表示相关性极显著(P<0.01)

2.5 模糊综合评判

单一指标的高低不能完全反映桑葚酒品质的好坏，因此考虑挥发酸含量、感官综合得分及与感官综合得分呈正相关的挥发性风味物质含量，采用模糊综合评判模型筛选最适合发酵桑葚酒的酵母。

2323、AC、FX10、F15、D254和F33发酵酒中与感官综合得分呈正相关的挥发性风味物质质量浓度为68 809.26、44 954.90、48 845.03、60 956.99、65 390.20和55 889.53 μg/L。

(1)建立判别对象集

U={U1,U2,U3,U4,U5,U6}，U1、U2、U3、U4、U5和U6分别代表2323、AC、FX10、F15、D254和F33酿制酒样。

(2)建立评判因素集

X={X1,X2,X3}，X1,挥发酸含量；X2,感官综合得分；X3,与感官综合得分呈正相关的挥发性风味物质含量。

(3)建立评判因素集

根据表2构造挥发酸因素函数，如公式(2)所示：

(2)

根据表4构造感官得分因素函数，如公式(3)所示：

(3)

与感官得分呈正相关的挥发性风味物质可构造线形上升函数,如公式(4)所示：

(4)

(4)建立权重集

(5)模糊综合评判计算

对每一因素利用U(Xi)模糊化，得到模糊关系矩阵；再用模糊线性变换，得到评判结果，归一化得：

B=[0.208 1 0.092 1 0.120 5 0.221 8 0.194 3 0.163 2]

模糊综合评判结果可表明酒样综合质量的优劣，从模型结果可得出不同酵母发酵桑葚酒的综合质量顺序为F15>2323>D254>F33>FX10>AC， F15最适合酿制桑葚酒。

3 结论

比较了2323、AC、FX10、71B、F15、D254、RC212、Top15、F33和KD 10株酵母发酵桑葚酒的挥发酸含量，只有2323、AC、FX10、F15、D254和F33六株酵母发酵酒挥发酸含量低于果酒限量标准(1.2 g/L，以乙酸计)。采用GC-MS分析了这6株菌发酵酒的挥发性风味物质，从物质总种类排序为AC=F33>F15>2323>FX10=D254，从物质总含量排序为2323>D254>F15>F33>FX10>AC。对6株菌发酵酒做了感官评价，感官综合得分为FX10>2323>F15>D254>AC>F33。对挥发性风味物质含量和感官综合得分做了相关性分析，发现挥发性风味物质含量与感官综合得分相关但不显著，其中，30种物质含量与感官综合得分呈正相关，14种呈负相关。综合考虑挥发酸含量、感官综合得分和与感官综合得分呈正相关的挥发性风味物质含量，采用模糊综合评判方法，最终模型结果显示不同酵母发酵桑葚酒的综合质量顺序为F15>2323>D254>F33>FX10>AC，酵母F15最适合酿制桑葚酒。