刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠Wnt3a/β-catenin表达的影响*

卢军，何承辉，阿依提拉·麦麦提江，康小龙

（1.新疆医科大学附属中医医院 药物研究室，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区药物研究所 药剂室，新疆 乌鲁木齐 830004）

系统性硬皮病的病理表现为多组织、多器官纤维化，免疫系统失衡及血管异常[1]。刺山柑为白花菜科山柑属植物，系新疆道地药材。刺山柑果实乙醇提取物对成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原的合成有一定抑制作用[2]。硬皮病模型小鼠的胶原沉积、真皮增厚等病理改变可被刺山柑流浸膏抑制[3]。给硬皮病小鼠外用刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物后，小鼠真皮增厚，Ⅰ型胶原、转化生长因子-β1过表达被抑制[4]。刺山柑总生物碱系本课题组从刺山柑中提取的有效成分，前期研究表明，将刺山柑总生物碱制成乳膏给系统性硬皮病小鼠外用后，小鼠皮肤增厚、纤维化等情况有所改善[5]，同时羟脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型胶原过表达被逆转[6-7]，提示刺山柑总生物碱可抑制系统性硬皮病胶原合成，改善组织纤维化。本实验观察刺山柑总生物碱对Wnt 通路相关蛋白Wnt3a、Wnt1 诱导的信号通路蛋白1（WISP1）和β-连环蛋白（β-catenin）的影响，研究其对系统性硬皮病Wnt/β-catenin 通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性BALB/c 小鼠90 只，体重18 ～22 g，购自北京维通利华实验动物公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.2 实验药物

刺山柑原药材（新疆麦迪森维药饮片厂），刺山柑乳膏（新疆医科大学附属中医医院药物研究室自制）盐酸博莱霉素注射剂（批号：17001711，上海瀚晖制药有限公司），青霉胺片（批号：052160901，上海上药信谊药厂）。

1.3 试剂

β-catenin 抗体、goat anti-rabbit IgG-HRP 购自美国Cell Signaling 公司，SABC 免疫组织化学染色试剂盒、小鼠WISP1 ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，高纯总RNA 快速提取试剂盒、SYBR real-time PCR 试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，小鼠Wnt3a ELISA 试剂盒购自武汉华美生物公司，蛋白测定试剂盒（BCA 法）购自江苏碧云天生物公司。

1.4 仪器

酶标仪（型号：Multiskan Spectrum）、低温离心机（型号：Multifuge X1R）购自美国Thermo Fisher 公司，显微镜（型号：LEICA DFC360 FX）、切片机（型号：LEICA RM2245）购自德国Leica 公司，实时定量PCR 仪（型号：C1000 Thermal Cycler）购自美国Bio-Rad 公司。

1.5 方法

1.5.1 小鼠系统性硬皮病模型的复制及给药方法BALB/c 小鼠90 只随机分为6 组：空白对照组、系统性硬皮病模型组（SSc 模型组）、刺山柑总生物碱低剂量组（225 mg/kg）、刺山柑总生物碱中剂量组（450 mg/kg）、刺山柑总生物碱高剂量组（900 mg/kg）及青霉胺组（125 mg/kg），每组15 只。剃除小鼠背部中央区被毛，除空白对照组背部皮下注射生理盐水外，其余各组皮下注射盐酸博莱霉素复制系统性硬皮病模型[8-9]：30 μg/d×30 d，然后各给药组小鼠背部外敷刺山柑乳膏，青霉胺组小鼠给予青霉胺灌胃，1 次/d×60 d。

1.5.2 小鼠皮肤组织Wnt3a 和WISP1 浓度的检测未次给药4 h 后处死小鼠，取小鼠背部皮肤用组织匀浆机研磨成10%组织匀浆，离心（4 000 r/min，10 min），ELISA 试剂盒测定上清液中Wnt3a 和WISP1 的浓度，ELISA 结果用上清液中总蛋白浓度（BCA 蛋白定量试剂盒检测）进行校正。

1.5.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测小鼠皮肤组织β-catenin mRNA 表达未次给药4 h 后处死小鼠，取小鼠背部皮肤，液氮迅速冷冻10 min，置入-80℃冰箱冷冻保存。采用高纯总RNA 快速提取试剂盒（离心柱型）提取组织总RNA，操作按试剂盒说明书进行，逆转录获到cDNA，设计特异性β-catenin 引物，β-catenin 正向引物为5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3'，反向引物为5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3'；内参照Rn18s 正向引物为5'-CTATTTTGGTTTTCGGAACTGAG-3'，反向引物为5'-TTGGCAAATGCTTTCGCTCTG-3'。采用2-△△Ct法计算mRNA 相对表达，即相对表达量=2-△△Ct，△Ct=Ct目标基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。

1.5.4 免疫组织化学法检测小鼠皮肤组织β-catenin蛋白表达未次给药4 h 后处死小鼠，取小鼠背部注射区皮肤，4%多聚甲醛中固定、脱水、包埋、切片。脱蜡，放入柠檬酸钠液中，微波修复5 min，用3%H2O2封闭20 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，β-catenin一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，DAB 染色后用苏木精复染。显微镜摄片后输入计算机，Image-Pro Plus 6.0 专业图像分析软件对图片进行分析,求得积分光密度与组织面积的比值即平均光密度，各组平均光密度与空白对照组平均光密度的比值作为β-catenin的相对表达量。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 11.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wnt3a 和WISP1 浓度的比较

各组小鼠皮肤组织Wnt3a 和WISP1 浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；SSc 模型组Wnt3a和WISP1 较空白对照组升高（P＜0.05）；刺山柑总生物碱中剂量组Wnt3a 较SSc 模型组降低（P＜0.05）；刺山柑总生物碱各剂量组、青霉胺组WISP-1与SSc 模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 β-catenin mRNA 相对表达量比较

各组小鼠皮肤组织β-catenin mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；SSc 模型组较空白对照组升高（P＜0.05），刺山柑总生物碱中剂量组、高剂量组及青霉胺组较SSc 模型组降低（P＜0.05）；刺山柑总生物碱中剂量组、高剂量组与青霉胺组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2和图1。

表1 各组小鼠皮肤组织Wnt3a 和WISP1 浓度比较（n =15，±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与SSc 模型组比较，P ＜0.05。

组别 Wnt3a/（pg/mg） WISP1/（ng/mg）空白对照组 182.79±47.05 1.32±0.36 SSc 模型组 293.17±59.66① 2.02±0.40①刺山柑总生物碱低剂量组 300.73±46.77 1.93±0.32刺山柑总生物碱中剂量组 245.77±56.09② 1.89±0.35刺山柑总生物碱高剂量组 269.84±44.64 2.11±0.44青霉胺组 274.84±39.48 2.00±0.50 F 值 11.336 7.499 P 值 0.000 0.000

2.3 β-catenin 蛋白相对表达量比较

免疫组织化学实验结果显示，各组小鼠皮肤组织β-catenin 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；SSc 模型组较空白对照组升高（P＜0.05）；刺山柑总生物碱各剂量组及青霉胺组较SSc 模型组降低（P＜0.05）；刺山柑总生物碱各剂量组与青霉胺组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3和图2、3。

表2 各组小鼠皮肤组织β-catenin mRNA 相对表达量比较 （n =15，±s）

表2 各组小鼠皮肤组织β-catenin mRNA 相对表达量比较 （n =15，±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与SSc 模型组比较，P ＜0.05。

组别 β-catenin mRNA 相对表达量空白对照组 1.00±0.00 SSc 模型组 2.50±0.39①刺山柑总生物碱低剂量组 2.30±0.40刺山柑总生物碱中剂量组 1.71±0.46②刺山柑总生物碱高剂量组 1.81±0.46②青霉胺组 1.37±0.39②F 值 10.620 P 值 0.000

图1 小鼠皮肤组织β-catenin mRNA 相对表达量比较（±s）

表3 各组小鼠皮肤组织β-catenin 蛋白相对表达量比较（n =15，±s）

表3 各组小鼠皮肤组织β-catenin 蛋白相对表达量比较（n =15，±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与SSc 模型组比较，P ＜0.05。

组别 β-catenin 蛋白相对表达量空白对照组 1.00±0.00 SSc 模型组 5.66±1.82①刺山柑总生物碱低剂量组 2.71±0.98②刺山柑总生物碱中剂量组 3.69±1.70②刺山柑总生物碱高剂量组 2.47±0.95②青霉胺组 2.91±1.50②F 值 5.524 P 值 0.003

图2 小鼠皮肤组织β-catenin 蛋白相对表达量比较（±s）

图3 小鼠皮肤组织β-catenin 蛋白表达情况 （免疫组织化学×100）

3 讨论

系统性硬皮病呈现多组织、多器官进行性纤维化，其病因与成纤维细胞异常增殖，胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度合成并沉积有关[10-11]。Wnt/β-catenin 信号通路是成纤维细胞持续活化的关键途径之一，在肺、皮肤等器官纤维化进程中起重要作用[12]。研究表明，在系统性硬皮病皮肤和肺组织成纤维细胞中Wnt/β-catenin 通路被激活，β-catenin 水平升高，导致系统性硬皮病成纤维细胞中β-catenin 蓄积，细胞核内β-catenin 水平升高使目标基因转录增加，引起系统性硬皮病组织纤维化[13-15]。Wnt3a 是Wnt 通路中的重要配体，WEI 等[16]和BAYLE 等[17]研究表明，Wnt3a/β-catenin 通路过度激活，可引起系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖，ECM 合成增加，异常增多的Wnt3a 与受体结合激活β-catenin 可引发系统性硬皮病组织纤维化，是因为后者可活化成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，使ECM合成增多。本研究发现，SSc 模型组小鼠皮肤Wnt3a和β-catenin 表达升高，与上述研究结果一致；刺山柑总生物碱450 mg/kg 可降低系统性硬皮病小鼠皮肤Wnt3a的浓度；450 mg/kg和900 mg/kg可降低β-catenin mRNA 和蛋白表达，提示刺山柑总生物碱对系统性硬皮病Wnt/β-catenin 信号通路的过度激活有一定抑制作用。

WISP1，又名CCN4，是Wnt/β-catenin 下游靶蛋白，有研究表明，多组织器官的纤维化过程都与WISP1水平的异常升高有关[18]。本实验发现，WISP1 在SSc模型组小鼠皮肤组织表达升高，提示WISP1 可能参与系统性硬皮病皮肤纤维化的形成；刺山柑总生物碱组WISP1 表达与SSc 模型组差异无统计学意义，提示刺山柑总生物碱可能不会改变系统性硬皮病小鼠WISP1的异常升高。