高通量测序及其在分子诊断领域的应用

张闫佳

高通量测序及其在分子诊断领域的应用

张闫佳

（河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007）

随着DNA测序技术的进一步成熟，我们对人类基因组和各类疾病在基因方面的研究得到了很大进展。通过对人类的基因组进行测序，我们已经能够比较全面地了解某些基因是如何运行的及其形式、功能。尤其在某些疾病的诊断方面，高通量测序技术（HTS）发挥着更大的作用。通过对患者病变细胞的基因组进行测序，已经能够对该种疾病进行更深入的研究，以改善许多疾病的诊断分类、预后和治疗选择。这种新的DNA测序方法正在向临床过渡，且可能使医学的各个领域，如诊断领域产生较大的变化。在这里将介绍目前为止利用高通量测序技术进行研究，进而得到的一些主要发现结果，有助于了解高通量测序在心血管疾病、智力障碍和苯丙酮尿症等疾病分子诊断中的应用。

DNA测序技术；高通量测序；分子诊断；基因

1 前言

随着科技的进步，人类的寿命也越来越长，这与人们对疾病方面的研究有着极大关系。以前，人们以为疾病是一种惩罚，没有任何科学依据。现在，随着人们对环境和人类基因的认知越来越深刻，人们了解到目前为止很多疾病都与环境或者基因，其中尤其是遗传病与基因有着非常大的关联。而从低通量测序到当下的高通量测序，我们对基因组的序列的理解更胜一筹。高通量测序技术能够对多个DNA分子进行并行测序，甚至使数亿个DNA分子做到同时测序。这一优势使得高通量测序可以用于创建大数据库，使我们对各种疾病和发育阶段的细胞基因组和转录组的特征有一个更全面的了解。高通量测序技术不仅极大地提高了DNA测序的效率，而且在很大程度上降低了成本。同时，由于该技术通常具有较好的特异性、较高的灵敏度和准确性，它在转录组学、表观基因组学以及基因变异的研究中有了很好的应用。

DNA测序技术的此项进展意味着病理学家、遗传学家和其他医学学科的成员现在看到的是大量新的遗传数据，这些数据为疾病的易感性、发病机制、预后和治疗策略提供了很大的帮助。而对于我们来说，了解这些使用新的高通量测序技术获得的数据、在获得测序结果后做出的选择以及在数据分析和表观遗传等方面是至关重要的。此外，除了处理这些数据得到的显而易见的结果之外，这些大量的高通量测序数据还包含了一些其他的发现，尽管有的发现目前的意义还不是很明确。但当进行到相关研究时，一定会显现出它的用途。

2 高通量测序与分子诊断

2.1 高通量测序技术

基因被转录成RNA，然后RNA被翻译成蛋白质，这即是分子生物学的中心法则。这个法则概述了基因的可变表达——如何从单个基因组动态地控制细胞地位和功能。基因是恒定的，但基因表达是动态的，而且会受到转录和翻译的影响，导致细胞内主要功能发生改变。

如果潜在的DNA序列发生突变，或者在转录和翻译过程中发生改变，细胞功能就可能受到影响，进而导致各种疾病的发生。虽然细胞所在的环境也会影响疾病的表现，但是许多疾病也有一个强大的潜在遗传成分。因此，为了评估一个人的遗传背景是否会导致疾病，需要大量的基因组和转录组数据库。通过对多个基因组进行测序，可以研究人类基因组的多样性。随着高通量测序技术的逐步发展，测序成本已经大大降低，很快就可以以更低的价钱来测序整个人类的基因组了。尽管如此，目前还面临着一个重要的挑战——将基因组测序用于临床方面的数据的准确性和可靠性。其实，每一种DNA测序技术都不可避免地有其错误模式和出错率。当前，许多高通量测序应用程序试图通过为每个要确定的碱基获得许多独立的序列，来克服这个障碍。在不久的将来，从高通量测序实验中获得的复杂数据的解释，将大大有益于生物学的研究。

靶向高通量测序基本是对患者的患病细胞进行测序，经过扩增后使用Illumina高通量测序方法进行测序。其中，可以利用在线设计工具设计一组测序引物，对若干个相关的基因的外显子和±10 bp侧内含子进行测序。用DNA样本来制备捕获的目标基因文库，然后在NEXTSEQ500测序器中对DNA文库进行测序。也可以用通用引物对线粒体（mt）16S rRNA基因进行扩增，同时使用Illumina高通量测序方法进行测序。总而言之，许多研究结果证明了这些靶向高通量测序方法的潜力，它可以全面描述测序出的基因组数据，并建立数据库，为开发更好地基于数据做出的策略以及在重要遗传疾病的预防方面作出更大的贡献。

2.2 遗传分析与分子诊断

2.2.1 疾病的遗传变异分析

在对高通量测序应用数据的分析中，经常出现一些关键问题。最重要的一个问题是如何处理罕见的序列变异，这可能是了解重要的个体病人的疾病的发病机理、预后或治疗的关键一步。但首先，在分析可能与人类疾病相关的基因组序列变异之前，我们必须先对健康人群的遗传变异有一个基本的了解。最近，1 000个基因组计划的试验阶段发现低频序列变异，并调查更罕见的变异，特别是外显子。而后，公布的数据从个体人类基因组序列和1 000人基因工程的初步结果，显示支持先前估计的人类基因组变异的频率位置。这些数据大大提升了我们对序列变异的类型和分布的理解。

2.2.2 来自高通量测序的分子诊断见解

人类可能至少有5 000～6 000个单基因疾病，目前大约有4 000种疾病与OMIM（在线孟德尔遗传数据库）中已知的基因变化有关。目前利用HTS发现致病突变的速度表明，在未来几年内，将确定导致许多其他疾病的突变序列。这些发现可能会促使疾病的重新分类，或者促使我们更好地理解疾病的临床症状。目前外显子组测序已经成功地在发现基因病上发挥较大作用。

3 高通量测序在各种疾病分子诊断中的应用现状分析

3.1 高通量测序技术阐明心血管疾病的分子途径

HTS有潜力在心血管研究中发挥重要作用，因为许多疾病具有未知的潜在遗传成分。例如，心律失常性右心室发育不良/心肌病（ARVD/C）是由桥粒相关突变引起的。虽然已经发现多种基因突变导致ARVD/C，但只有50%～60%的ARVD/C患者发现潜在的基因突变。此外，ARVD/C的一些临床表现与Brugada综合征非常相似。而全基因组和外显子组测序使我们发现以前未知的导致心血管疾病的突变，并有助于区分具有非常相似临床表现的不同疾病。

高通量测序技术的进步使心脏发育和疾病过程的表征更加准确和全面。随着不同平台对HTS应用程序的改进，将为生物过程的功能提供更完整的分子图像。这对我们找寻心血管疾病更安全、更有效的治疗方法有很大帮助。HTS技术的实施将在确定心血管疾病发展和疾病的分子通路方面具有不可估量的价值。

3.2 采用靶向高通量测序对智力障碍进行分子诊断

智力障碍（ID）是一种常见的神经发育障碍，在儿童和青少年中发病率为1.5%～2%。分类智力障碍（ID）的特征是极端的遗传异质性。但几百个基因与单基因形式的ID相关，这大大增加了分子诊断的复杂性。Claire Redin和他的团队鉴定了26个致病突变中的16个，常染色体显性基因中的10个新生突变。其中，一些基因多次出现，表明它们更频繁地与ID相关条件对应。

结果表明，靶向测序的诊断率为25%。在这些患者中，不论其认知障碍的严重程度如何，有25%的患者都检测到一种因果突变。这项工作表明，靶向测序方法在诊断ID方面是高效的，也将有助于我们更好地了解ID和自闭症中涉及的许多基因的具体功能。

3.3 采用高通量靶向测序对苯丙酮尿症和四氢生物碱缺乏的高苯丙氨酸血症进行分子诊断

苯丙酮尿症（PKU）和四氢生物碱缺乏的高苯丙氨酸血症（BH4DH）的遗传诊断，曾经依赖于扫描已知突变的方法或使用Sanger测序的一些费力的分子工具。目前，Daniel Trujillano和他的团队实现了一种基于4个基因的高通量多靶点重测序的新型高效策略，当这些基因受到功能缺失突变的影响时，就会导致PKU和BH4DH。他们已经在95个样本中验证了这一方法，检测样本中所有已知的致病突变。然后，使用MiSeq测序仪对11例无特征的HPA患者进行了相同的捕获分析。他们的研究证明了高通量靶向重测序已准备好替代经典分子方法来进行BH4DH的鉴别遗传诊断，允许在出生后几天内建立专门定制的治疗，有很高的使用价值。

4 问题及展望

高通量测序方法具有成本低、诊断速度快、精度高等优点，同时可以检测到大量的突变，通常也可以做出精确的分子诊断，然而，基因测序作为一个领域还不够成熟，面临着更多的技术挑战。例如，为了使测序在临床中得到更广泛的应用，准确性是至关重要的，可能会存在一些数据的可用性和能力之间的差距。这一差距可能需要更好的算法来纠正阅读错误，并借助先进的分子生物学技术。

因此，HTS基因检测是诊断设备的强大补充，但可能不会完全取代目前的大多数诊断方法。将高通量DNA测序数据集纳入患者的临床护理还需要一段过渡期，在此期间，临床决策将仅基于对已知重要性的序列变异的可靠解释。尽管这一知识体系已经变得复杂而详细，但迄今为止通过高通量靶向测序方法几乎在所有医学领域取得的重大发现，可能只是对未来的一瞥。

［1］张坡，李茜，朱艳，等.靶向捕获高通量测序技术在遗传性疾病分子诊疗中的应用［J］.中国妇幼保健，2019，34（10）：2313-2315.

［2］鲍芸，肖艳群，王华梁.高通量测序技术在五类疾病分子诊断中的应用及质量管理策略［J］.中华临床实验室管理电子杂志，2018，6（2）：69-73.

R440

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.071

2095－6835（2020）12－0160－02

张闫佳（1999—），女，河南辉县人，河南师范大学2017级生物科学专业在读本科生。

〔编辑：王霞〕