大蒜浸提液对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除作用研究

曹楚珩，何妍庆，梁绮琦，钟家本，李素策，乔娜，陶志华

(广东工业大学 轻工化工学院，广州 510006)

1 概述

咸鱼是通过添加食盐腌制后风干而成的鱼类制品。因其营养价值高、风味独特而深受消费者的喜爱。咸鱼中含有人体所必需的氨基酸、赖氨酸等；咸鱼含有人体必需脂肪酸——不饱和脂肪酸，有助于大脑及神经发育，对于提高孩子智力、防止动脉硬化和心血管疾病等有重要作用；同时咸鱼还含有丰富的维生素及矿物质[1]。但是由于腌制咸鱼含有高盐，在腌制过程中会产生硝酸盐和亚硝酸盐的混合物。除此之外，生产过程中还会添加硝酸盐和亚硝酸盐作为发色剂[2,3]。由于鱼肉中微生物的作用，硝酸盐被还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐具有一定毒性，作为强氧化剂，进入人体血液后可使血液中正常的低铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白，使其失去载氧功能[4]。人体摄入过多亚硝酸盐后，在组织代谢作用下生成强致癌物质亚硝胺,引起食物中毒甚至死亡，引发食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌等[5,6]。

亚硝酸盐引起的食物中毒现象屡见不鲜。2011年7月，在某市一酒店内食用鲍鱼汤而引发149人亚硝酸盐食物中毒事件的报道。2012年7月，滦县发生一起因食用亚硝酸盐含量超标的食物而中毒的报道。2016年，吴晓军报道了1例因食用变质南瓜而引起的亚硝酸盐含量超标现象。2016年6月，贵州报道了1例因食用酸菜而引发的亚硝酸盐中毒现象[7-10]。

腌制咸鱼中亚硝酸盐的产生在目前阶段仍无法避免。找到一种加工食用兼具的方法，是解决腌制咸鱼中亚硝盐降解的关键。近年来，已经有通过乳酸菌发酵泡菜而降解泡菜中亚硝酸盐的研究[11]，而腌制咸鱼工艺过程不是乳酸菌发酵得到的产品，需要适合加工食用的方法降解亚硝酸盐。研究表明，山葵、大蒜中含有的大蒜素、硒和维生素C等可阻断硝酸盐向亚硝酸盐转化[12-14]。除此之外，大蒜中含有巯基化合物，能够与亚硝酸盐形成酯类化合物，从而降低亚硝酸盐的含量，大蒜能够阻断亚硝胺等致癌物质的合成，减少患癌的风险[15]。因此，利用大蒜的提取液研究对咸鱼中亚硝酸盐的清除效果，具有重要的应用价值，能达到医食同源的目的。

为探讨大蒜提取液对咸鱼中的亚硝酸盐清除作用的影响，本文将对咸鱼中的亚硝酸盐含量进行检测，并计算清除率，从而确定最佳的提取条件。

2 实验材料与方法

2.1 材料与试剂

鲜鱼、大蒜、亚铁氰化钾、冰乙酸、乙酸锌、硼砂、盐酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠。

2.2 仪器

725N紫外可见分光光度计、离心机、酸度计、电子天平、果蔬料理机、恒温水浴锅、真空抽滤器。

2.3 咸鱼的腌制

挑选新鲜的鱼7条，重量在60 g左右，清洗处理内脏，晾干表面的水，其中4条咸鱼涂抹1∶3浓度的盐水至有盐水析出，静置20 h。

2.4 试剂的配制

亚铁氰化钾溶液(106 g/L)：称取10.6 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至100 mL。

乙酸锌溶液(220 g/L)：称取22.0 g乙酸锌，用3 mL冰乙酸溶解，用水稀释至100 mL。

饱和硼砂溶液(50 g/L)：称取5 g硼酸钠，溶于100 mL热水中，冷却后备用。

盐酸(20%)：量取20 mL，用水稀释至100 mL。

对氨基苯磺酸(4 g/L)：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100 mL 20%盐酸中，混匀置于棕色瓶中，避光保存。

盐酸萘乙二胺(2 g/L)：称取0.2 g盐酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混匀置于棕色瓶中，避光保存。

亚硝酸钠标准溶液(200 μg/mL，以亚硝酸钠计)：准确称取0.1000 g与110～120 ℃干燥恒重的亚硝酸钠混合，加水溶解，移入500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

亚硝酸钠标准使用液(5.0 μg/mL)：临用前，吸取2.50 mL亚硝酸钠标准溶液，置于100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。

2.5 实验方法

2.5.1 标准曲线的制备

分别吸取0.00,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45 mL亚硝酸钠标准溶液(相当于0.00,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09 μg亚硝酸钠)，分别置于25 mL比色管中，然后分别加入1 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，加水至刻度，混匀，静置15 min，同时做空白试剂。以空白样调节零点，于波长538 nm处测吸光度，绘制标准曲线。亚硝酸盐含量与吸光度标准曲线的关系见表1，标准曲线见图1。

表1 亚硝酸盐含量与吸光度标准曲线的关系

图1 标准曲线

2.5.2 大蒜浸提液的制备

将大蒜剥皮、洗净、晾干，称取200 g于果蔬料理机中搅碎，用蒸馏水转入烧杯中，水浴10 min，用纱布过滤，10000 r/min离心10 min，抽滤，得滤液备用。

2.5.3 咸鱼的处理

将腌制咸鱼置于果蔬料理机中搅碎，称取2.5 g于100 mL锥形瓶中，加入6.25 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，加入70 ℃约75 mL的蒸馏水，于沸水浴中加热15 min，冷却至室温后，将样品全部转入100 mL容量瓶中，然后加入2.5 mL亚铁氰化钾溶液和2.5 mL乙酸锌溶液，加水至刻度，混匀，4000 r/min离心10 min，抽滤，得滤液备用。

2.5.4 清除率的测定

取10 mL 2.5.3所得滤液，置于25 mL比色管中，加入6 mL大蒜浸提液，用乙酸调pH至3.5，摇匀，静置反应一段时间，加入0.4%对氨基苯磺酸1 mL，摇匀静置4 min，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，摇匀，定容至刻度，静置15 min。以试剂空白做参比，于波长538 nm处测定吸光度，计算亚硝酸盐的清除率。大蒜浸提液对亚硝酸盐清除率的公式：

R=(A1-A2)/A1。

式中：R为清除率(%)，A1为未加大蒜浸提液时样品溶液的吸光度，A2为加大蒜浸提液后样品溶液的吸光度。

2.5.5 不同提取剂的影响

分别用蒸馏水和乙醇作为大蒜提取液的提取剂，通过实验分析不同提取剂的清除效果。

3 结果与讨论

3.1 大蒜浸提液清除腌制咸鱼中亚硝酸盐的最优条件

探讨大蒜浸提液与腌制咸鱼中亚硝酸盐的反应介质的pH值、大蒜浸提液浓度、大蒜浸提液浸提温度、大蒜浸提液的量这4大因子，研究影响大蒜浸提液对腌制咸鱼亚硝酸盐清除效果的因素。

3.1.1 大蒜浸提液浓度对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除效果

将搅碎的蒸馏水和大蒜按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的比例配制好，水浴加热10 min，冷却至室温，10000 r/min 离心10 min，取上层清液备用。

取5份10 mL咸鱼提取液，置于25 mL比色管中，分别加入上述大蒜提取液10 mL，反应一段时间，加入0.4%对氨基苯磺酸1 mL，摇匀，静置4 min，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，摇匀，定容至刻度，静置15 min。以试剂空白做参比，于波长538 nm处测定吸光度，计算不同浓度的大蒜浸提液对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除率。

图2 大蒜浸提液浓度对腌制咸鱼中亚硝酸盐清除率的影响

由图2可知，大蒜浸提液浓度为3∶1时，清除率最高，为52.94%，浓度过高或者过低都不利于腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除效果。

3.1.2 大蒜浸提液浸提温度对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除效果

将搅碎的大蒜配制成浓度为3∶1的浸提液，分别在60，70，80，90，100 ℃的温度下浸提，冷却至室温，10000 r/min 离心 10 min，取上层清液备用。

取5份10 mL咸鱼提取液，置于25 mL比色管中，分别加入上述大蒜提取液10 mL，反应一段时间，加入0.4%对氨基苯磺酸1 mL，摇匀，静置4 min，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，摇匀，定容至刻度，静置15 min。以试剂空白做参比，于波长538 nm处测定吸光度，计算不同温度的大蒜浸提液对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除率。

图3 大蒜浸提液浸提温度对腌制咸鱼中亚硝酸盐清除率的影响

由图3可知，大蒜浸提温度为70 ℃时，清除率最高，为44.93%，温度过高时，清除率下降，原因可能是大蒜提取液中的有效成分被破坏。

3.1.3 大蒜浸提液的量对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除效果

将浓度为3∶1的大蒜浸提液置于70 ℃水浴加热10 min，冷却至室温，10000 r/min 离心 10 min，取上层清液备用。

取7份10 mL咸鱼提取液，置于25 mL比色管中，分别加入大蒜提取液0，2，4，6，8，10，12 mL，反应一段时间，加入0.4%对氨基苯磺酸1 mL，摇匀，静置4 min，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，摇匀，定容至刻度，静置15 min。以试剂空白做参比，于波长538 nm处测定吸光度，计算不同大蒜浸提液的量对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除率。

图4 大蒜浸提液的量对腌制咸鱼中亚硝酸盐清除率的影响

由图4可知，随着大蒜浸提液用量的增加，腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除率先升高后降低，当大蒜浸提液用量为6 mL时，清除率最高，为31.25%。这可能是由于较少量的大蒜浸提液与腌制咸鱼中的亚硝酸盐未完全反应，而较多量的大蒜浸提液与腌制咸鱼中的亚硝酸盐反应完全后还有剩余，对吸光度产生了影响。

3.1.4 pH对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除效果

将浓度为3∶1的大蒜浸提液置于70 ℃水浴加热10 min，冷却至室温，10000 r/min 离心 10 min，取上层清液备用。

取5份10 mL咸鱼提取液，置于25 mL比色管中，分别加入大蒜提取液6 mL，用乙酸调节反应液pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，反应一段时间，加入0.4%对氨基苯磺酸1 mL，摇匀，静置4 min，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，摇匀，定容至刻度，静置15 min。以试剂空白做参比，于波长538 nm处测定吸光度，计算不同pH对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除率。

图5 pH对腌制咸鱼中亚硝酸盐清除率的影响

由图5可知，反应介质pH为3.5时，腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除率最高，为30.49%。

3.2 不同提取剂的影响

图6 不同提取剂清除率变化图

由图6可知，通过0～12 d对样品的处理，并且通过分析测试得到水作为提取剂的清除效果最佳。最高在第11天，能达到68%的清除效果。

4 结论

实验结果表明，随着大蒜浸提浓度的减小，清除率先增加后减小，在其他条件相同时，当大蒜浸提液浓度为3∶1(水∶大蒜)时，清除率最高，为52.94%；当大蒜浸提液浸提温度为70 ℃时，清除率最高，为44.93%，浸提温度超过70 ℃，清除率逐渐降低；随着大蒜浸提液用量的增加，清除率先增高后降低，当大蒜浸提液用量为6 mL时清除率最高，为31.25%；反应液pH为3.5时清除率最高，为30.49%。

通过实验可知不同提取剂的提取效果差别比较大，可以看出清除亚硝酸盐有效物质更易溶于水，而且亚硝酸盐也易溶于水，用水作提取剂可以增大二者的接触面积，从而提高反应效率。

综上，大蒜对腌制咸鱼中亚硝酸盐的清除作用最佳条件为：以蒸馏水作浸提剂，大蒜浸提液浓度为3∶1，大蒜浸提液浸提温度为70 ℃，大蒜浸提液用量为6 mL，反应液pH为3.5；最佳清除天数为11 d，能达到68%的清除率。

通过实验发现，大蒜对腌制咸鱼中亚硝酸盐有清除作用，因此食用大蒜能有效除去腌制咸鱼中的亚硝酸盐，对人体的健康有一定的益处，达到医食同源的效果。