浅谈类固醇激素检测技术的发展

田慧东 王献

中南民族大学化学与材料科学学院

一、简介类固醇激素

类固醇激素又称甾体激素，是一类具有环戊烷多氢菲母核的四环脂肪烃化合物，是脂溶性小分子激素，同时它也具有极重要的医药价值[1]。类固醇激素主要由肾上腺、胎盘和生殖腺产生，它是由胆固醇经一系列酶催化代谢产生，通过内分泌系统调节人体新陈代谢，在维持生命、调节性功能，机体发展、免疫调节等方面有明确的作用。类固醇激素包括糖皮质激素(皮质醇)，盐皮质激素(醛固酮)，雄激素，雌激素和孕激素。胆固醇是类固醇激素的生物合成前体，有27个碳，而孕激素，盐皮质激素和糖皮质激素有21个碳，雄激素有18个碳，雌激素有19个碳。

内分泌系统疾病可导致体内相应激素水平发生变化，如醛固酮增生症、先天性肾上腺皮质增生、多囊卵巢综合征等，临床上可依此对一些疾病进行诊断和监测。类固醇激素的异常主要可导致肾上腺疾病和性腺疾病。先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia)，简称CAH，是一组由肾上腺皮质类固醇合成通路各阶段各类催化酶的缺陷，引起以皮质类固醇合成障碍为主的常染色体隐性遗传性疾病。21-羟化酶缺陷是CAH中最常见的一种，该酶的缺陷会导致17α-羟孕酮、孕酮、雄烯二酮和脱氢异雄酮的浓度升高，而醛固酮、皮质酮和皮质醇的浓度降低。多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是一种常见的育龄期妇女的内分泌疾病，以雄性激素过多、排卵功能障碍和多囊卵巢形态为主要临床特点，临床检测发现睾酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮硫酸盐的浓度会显著升高。因此，临床上通过对类固醇激素的检测并分析了解它们之间的相互关联，才能帮助医生对相关疾病进行诊断和治疗监测。

二、液相色谱-质谱联用技术(HPLCMS)

液相色谱-质谱联用简称液质联用(HPLC-MS)，液质联用通过液相色谱部分将分析物进行分离，再由质谱进行检测，最终得到质谱图。不同分析物其电离情况会有所不同，质谱就是依据带电物质的质量差异来进行分析识别的。英国物理学家Thomson最早提出质谱的检测原理。起初，质谱仪仅仅能对一些分子量小且热稳定化合物进行检测。随着离子化技术的发展，出现了电喷雾离子化技术（ESI）和基质辅助激光解析离子化技术（MALDI），至此，质谱仪的应用范围更加广泛，在医疗检测及疾病诊断方面发挥了重要作用。质谱仪器的基本构成部分有进样系统、离子源、质量分析器、检测器、数据分析系统等，质谱仪器的不同关键在于离子源和质量分析器的不同。

（一）离子源

质谱检测的基础是分析物能够被离子化，离子化是进行质谱检测的前提，因此离子源在质谱仪器中的作用尤为重要。不同的离子源有不同的离子化方式。现在常用的离子化方法有:电喷雾电离（ESI）,基质辅助激光解析电离（MALDI），大气压化学离子化（APCI）和大气压光离子化（APPI）等等。其中最常用的离子化方法是电喷雾电离。

（二）质量分析器

质量分析器位于离子源和检测器之间，可以依据不同方式将离子源中生成的样品离子按质荷比（m/z）的大小分开，主要类型有磁分析器、飞行时间分析器、四极滤质器、离子阱和离子迦旋共振分析器等。样品离子经质量分析器分开后再进入检测器，最终得到相应的质谱图。

液质联用体现了色谱和质谱的优势互补。色谱的优势在于对复杂样品的分离，具有高分离能力，为混合物的分离提供了最有效的选择。质谱具有高选择性、高灵敏度，能够提供物质的相对分子质量与结构信息。质谱虽然所需样品量比较小，但需要对样品进行一定的前处理操作，去除一些影响测定的杂质，只有满足一定要求的样品才可以进样分析，否则会对仪器造成一定的损伤。

（三）液质联用的发展

伴随着科学技术的发展，各种新兴质谱仪器不断出现与改进，出现了多种类型的质谱检测器，它们的区别主要在质量分析器。四级杆质量分析器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器是目前常见的几种质量分析器。不同类型的质量分析器可以互相组合串联，从而产生不同的质谱仪，如:四级杆-离子阱串联质谱等等。目前比较常用的质谱仪器有:四极杆质谱仪、四极杆离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和离子回旋共振质谱仪等。液相色谱-质谱联用技术（LCMS/MS）应用广泛，在医疗、环境监测、食品检测、化工生产等各个方面都有所体现。良好的液相色谱分离能力以及高特异性的串联质谱检测，使得该技术有很好的复杂生物样本的分析检测能力。其中LC-MS/MS技术在临床诊断方面发展势头尤为迅猛。

三、类固醇激素检测方法的发展

类固醇激素在人体内的含量很低，一般在nmol/L和pmol/L数量级,各种类固醇激素的分离和定量检测也比较困难[2]。关于前处理方面，因液液萃取操作简便，可对类固醇激素进行富集浓缩，其运用比固相萃取或者衍生化方法广泛[3]。目前，测定类固醇激素常用的方法主要有生物法和化学法，生物法包括放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等，化学方法主要有气相色谱法[5]、液相色谱法[6]、气质联用法(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS/MS)[4]、液质联用法(high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)[7]。

图1 超高压液相色谱串联四级杆质谱仪

21世纪[8]以来，用LC-MS/MS方法来检测类固醇激素显得更加普遍，因为LC-MS/MS方法通常更适合于生物样品分析，同时具有较高的特异性。近年来，随着超高液相色谱（UPLC）与灵敏度更高的质谱联用的出现，LC-MS/MS已成为甾体化合物分析的一种优势技术。目前对于类固醇激素的检测，首选三重四级杆液相色谱质谱联用仪，其中超高压液相色谱串联四级杆质谱仪（UPLCMS/MS）的使用更为广泛（见图1）。

目前主要采用的前处理方法有蛋白沉淀（PP），固相萃取（SPE）和液-液萃取（LLE）。

（一）蛋白沉淀法（PP）

蛋白沉淀法（PP）是最简单的前处理技术，并且可以在96孔板中自动化大批量进行，同时还可以减少不必要的复杂的样本转移步骤。固相萃取法（SPE）和液-液萃取法（LLE）相对于PP的主要优势是能够提供更干净的样本提取物，并且这两种方法也有富集浓缩分析物的能力，从而提高检测的灵敏度。由于用上述两种技术提取的类固醇用的都是一些强溶剂不能直接注入LC-MS/MS仪器，因此氮气吹干溶剂再用溶剂重构便成为这两种方法的必要步骤，但是该方法也带来了前处理的复杂性。现在有一种微洗脱SPE方法，这种SPE方法因为柱填充所用材料较少能够用较少量的溶剂洗脱吸附物质，而这些少量的溶剂则可以在不影响灵敏度的情况下直接注入LC-MS/MS。

（二）液-液萃取（LLE）

液-液萃取（LLE）是在血液或者尿液等基质中加入不混溶的有机溶剂，常用的有己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚等，从而将分析物提取出来。基于所需提取分析物来选择合适的提取溶剂，可以获得高回收率和可忽略的基质效应。LLE虽然很有效，但是也有缺点比如难以自动化，需要使用通风厨来放出蒸汽溶剂等。

（三）固相萃取（SPE）

固相萃取（SPE）步骤包括：活化柱子，上样样本，淋洗，洗脱等步骤，是依赖于将分析物吸附在固定化的介质中，然后将蛋白质和基质干扰物等淋洗到废液中，最后用有机溶剂通常是甲醇和乙腈洗脱分析物。现在可用的SPE装置所用填料很多，比如疏水型的，离子交换型等固定相，如果在用SPE前处理时选择与分析物相匹配的固定相，那么所获得的样本就会变得很干净。SPE比LLE有着更加广泛的适用性，但SPE有一个很大的缺点就是色谱柱成本相对于LLE更昂贵，SPE色谱柱既可以单独的手动使用，也可以在96孔板中自动化进行，这种方式的前处理称之为离线SPE。SPE也可以以在线的方式使用，在进样的过程中使用弱溶剂淋洗SPE小柱通往废液，然后再用阀门切换到分析柱中，切换至分析柱时用强溶剂洗脱分析物，使分析物经分析柱进入质谱，这样就做到了样本处理的自动转换。无论是在线SPE还是在线SPE和LLE的组合，都不一定能获得较高的分析物灵敏度。然而，在LC-MS / MS之前加上在线SPE 往往会大大缩短检测所用的时间，其自动化程度和检测激素的种类也都会大大提高，但是其方法的开发就比较繁琐了。

结语：我们相信，超高压液相色谱串联四级杆质谱仪（UPLC-MS/MS）将在类固醇激素检测中发挥至关重要的作用。液相色谱-质谱联用技术在类固醇激素的检测中的优势主要在于高通量，高灵敏度，高精确度等等，它在食品检测、临床诊断和基础研究等方面发挥了至关重要的作用，也将推动当今临床医疗事业的蓬勃发展，对健康评估和疾病诊断均具有重要意义。未来，液相色谱-质谱联用技术在类固醇激素的检测中将向“操作简单，步骤简便，快而准出结果”等方面不断改进与完善。