沙门菌噬菌体抗性菌的筛选鉴定及致病力研究

马晓娟 秦晏捃

内蒙古双奇药业股份有限公司 内蒙古呼和浩特 010021

沙门菌是一种肠道致病菌，人体感染后可出现明显的腹泻表现，也是引起食物中毒的主要病原菌之一。当前研究显示，常见的鸡蛋、蛋制品、猪肉、奶酪等均存一定的的沙门菌感染问题[1]。随着抗生素药物的不合理使用，耐药菌问题日益严重，并得到了众多学者的关注，噬菌体较抗生素在细菌性感染疾病治疗与预防方面更具有优势，噬菌体作为一种微生物，实际在感染性疾病治疗与预防方面也可能出现抗性问题[2]。对此，本文通过沙门菌噬菌体抗性菌的筛选鉴定及致病力研究，便于为噬菌体抗性问题以及其安全使用提供依据，现就相关内容分析如下。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

肠炎沙门菌标准菌株，ATCC13076，噬菌体PA13076。雌雄小鼠若干，雌雄各占一半，体重：20-22g，5 周龄ICR 小鼠，小鼠需要提前进行1w 饲养，适应后开展攻毒实验。保存在液氮罐中的小鼠肠道上皮细胞（MODE-K）。试剂：LB 培养基，琼脂糖、琼脂粉、胎牛血清、DEDM 细菌培养液、毒力岛基因、肠毒素等。主要仪器有离心机、生物安全柜、恒温振荡器、凝胶成像分析仪等。

1.2 方法

对无诱变条件下形成的沙门菌噬菌体抗性菌通过次级感染法予以筛查。

于LB 琼脂平板对沙门菌ATCC13076 进行划线，37℃，连续培养24h，5mlLB 液体培养基接种单菌落，振荡培养过夜，37℃，2000r/min，按照1:100 接种到新鲜LB 培养基中，使其OD600=0．5，感染复数（MOI）=1．0 时，将噬菌体PA13076 接入，37℃培养，培养约5h，保证培养液完全裂解，37℃，培养24h。LB 琼脂平板均匀涂抹100μL 裂解液，37℃，培养24h，LB 液体培养基接种单菌落，连续进行3 次划线，对细菌纯化处理，得到噬菌体抗性菌株。

沙门菌噬菌体抗性菌鉴定：通过新鲜的ATCC13076 与噬菌体抗性菌液完成点样实验，并依次完成吸附率测定、遗传稳定性、抗性菌与宿主菌生长曲线分析、毒力基因检测，然后实施小鼠抗性菌半数致死量（LD50）测定，细胞粘附力测定等。所有操作均由实验室专业人员按照相关操作标准完成。

2 结果

初步筛查后获得10 株PA13076 裂解抗性菌，通过遗传稳定性分析，噬菌体接入并实施连续培养，只有R3 对沙门菌噬菌体有抗性。R3 生长良好，为革兰氏阴性杆菌。噬菌体能够对沙门菌裂解，但是对R3 无作用。宿主菌生长速度略大于噬菌体抗性菌株R3，抗性菌株和宿主菌在生化、毒力基因检测方面无差异，抗性菌R3同宿主菌在MODE-K 细胞粘附能力方面差异较小。

3 讨论

沙门菌噬菌体抗性菌的筛选鉴定及致病力研究能够为噬菌体的实际应用提供理论依据，为噬菌体在抗感染治疗方面的详细应用奠定基础。

本次研究中对沙门菌噬菌体通过次级感染法、琼脂平板法进行筛查，通过裂解试验得到了自发性稳定的噬菌体抗性菌。通过次级培养可获取抗噬菌体突变菌株。抗性菌同宿主菌均为革兰氏阴性杆菌，且两者在菌体与菌落形态方面差异较小。抗性菌的遗传稳定性较好，能够对噬菌体PA13076 感染产生抵抗，噬菌体对抗性菌R3不具有吸附功能，分析可能是抗性菌表面受体发生异常改变，影响到噬菌体的识别与作用。

噬菌体抗性菌株同宿主菌相比，其致病力、粘附率都有所下降，表明动物体内的噬菌体抗性菌毒性在呈现出下降趋势，分析可能是因为动物体内的免疫系统、吞噬细胞能够更好的识别噬菌体抗性菌，造成其在动物体内的毒性下降。细菌和噬菌体的进化在是自然中发生的，实验室检查中，细菌对噬菌体存在抗性，但是从现实角度分析，噬菌体抗性只是噬菌体治疗期间可能遇到的一个问题。

仇笑笑[3]研究中指出噬菌体CR5 是一种裂解性噬菌体，长尾科，抑菌作用明显，且具有较好的温度耐受性。曹中赞等[4]分析了噬菌体制剂沙立宁对鹅源沙门菌感染的抑菌效果，研究证实噬菌体制剂沙立宁可明显减少雏鸡肝和盲肠载菌量，炎症反应显著减轻或消失，证实了噬菌体制剂沙立宁在鹅源沙门菌感染方面有较好的应用效果。

综上所述，噬菌体同噬菌体宿主在毒力基因、生物学特性方面无变化，而噬菌体抗性菌株的致病力下降，MODE-K 细胞粘附能力不受影响。