基于3D生物打印技术的体外模拟肿瘤转移模型研究

杨超 高嘉悦 许崇龙

摘要：肿瘤的易转移性与死亡率密切相关，但目前对其转移的确切机制研究较少，主要是因为当前常用的肿瘤体外模型不能充分模拟超微环境下肿瘤微环境的三维和异质性特征。随着3D打印技术和生物材料的发展，采用3D打印技术模拟出的肿瘤体外模型已基本接近体内肿瘤微环境。本文主要综述3D生物打印的材料的方法，及其构建异质肿瘤微环境的体外模型应用现状，总结了3D生物打印技术在重建肿瘤微环境中的应用和局限性，旨在为临床制定抗癌策略提供参考。

关键词：3D生物打印;体外模型;肿瘤微环境;肿瘤转移

中图分类号：R730                                   文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.009

文章编号：1006-1959（2020）20-0030-04

Research on in Vitro Simulated Tumor Metastasis Model Based on 3D Bioprinting Technology

YANG Chao1，GAO Jia-yue2，XU Chong-long3

（1.Liaoning National Normal College，Shenyang 110032，Liaoning，China;

2.Military Medical Sciences，Beijing 100853，China;

3.Qizhi Technology Shenyang Co.，Ltd.，Shenyang 110032，Liaoning，China）

Abstract：Tumor metastasis is closely related to mortality， but there are currently few studies on the exact mechanism of its metastasis， mainly because the commonly used tumor in vitro models cannot fully simulate the three-dimensional and heterogeneous characteristics of the tumor microenvironment in the ultramicro environment. With the development of 3D printing technology and biomaterials， the tumor in vitro model simulated by 3D printing technology has basically approximated the tumor microenvironment in vivo. This article mainly reviews the methods of 3D bioprinting materials and the application status of in vitro models for the construction of heterogeneous tumor microenvironment. It also summarizes the application and limitations of 3D bioprinting technology in reconstructing the tumor microenvironment， aiming to formulate anti-cancer for the clinic strategy provides reference.

Key words：3D bioprinting;In vitro model;Tumor microenvironment;Tumor metastasis

目前，全球范围内恶性肿瘤发病率逐年升高，并直接导致死亡率升高，2019年全球约有1808万新发病例和956万死亡病例[1]。肿瘤引起较高死亡率的原因为其起病隐匿、大部分患者就诊时即确诊为具有远端转移的晚期肿瘤，与5年生存期下降直接相关[2]。尽管2D模型对肿瘤的发生及发展带来了许多重要的发现，但人们越来越认识到3D模型可以概括地模拟出肿瘤生物学的各个方面功能，帮助研究者更好地理解肿瘤细胞在疾病进展过程中所处的生物、物理和生化环境，包括细胞增殖、细胞3D迁移、营养和代谢废物扩散动力学、新血管生成及血管内外侵袭等[3，4]，更有助于阐明恶性肿瘤进展的潜在机制，从而提高对治疗靶点的识别。据统计，未来20年内肿瘤发病率将从2019年的1808万上升到超过2200万，死亡率亦将随之增加[5]，极大地增加了医疗负担，因此肿瘤治疗策略的更新迫在眉睫。本文主要就几种当前用于组织工程的3D打印技术在重建肿瘤微环境中的方法进行综述，旨在为抗癌新策略的发现提供帮助。

1肿瘤微环境

细胞微环境是包围所有真核细胞的一种普遍存在的结构特征，其由多种分子组成，在细胞信号和组织结构中起着不可或缺的作用。对于肿瘤细胞来说，肿瘤微环境不是静态的，其不仅具有肿瘤组织特异性，并且显著影响肿瘤细胞行为，如诱导肿瘤细胞的侵袭行为等[6]。肿瘤细胞受微环境的特征影响转移的进程，包括肿瘤的机械刺激、细胞因子细胞-基质之间相互作用、基质中氧以及營养物质浓度、代谢废物和细胞组织结构特征[7]。肿瘤细胞通过与内皮细胞旁分泌信号传导来分泌血管内皮生长因子和其他促血管生成因子，通过已存在的及新生的血管网络进行远端转移[8]。肿瘤细胞渗入血管后，循环肿瘤细胞会以某种方式渗入其他类型的组织，以建立肿瘤细胞的继发性集落。因此，抑制新血管生成是体外研究肿瘤转移及扩散的关键。

体外肿瘤模型需要模拟出实际肿瘤微环境的关键特征，由于肿瘤扩散（相关因素：细胞因子、营养素和代谢废物）和远端转移（影响因素：肿瘤内外侵袭、炎症细胞募集）均是动态进行的，所以任何转移的体外模型都应该是3D的。目前，动物模型和临床试验之间取得的一致性结果较低，平均仅8%，一致性仍是具有挑战性的难题[9]，3D体外肿瘤模型将通过概括与疾病类型和阶段相匹配的适当肿瘤细胞/基质组成和特性，从而精确模拟患者体内的肿瘤微环境，提供准确的机制研究以及个性化抗癌治疗药物筛选的工具。

2 3D 生物打印

3D打印辅以计算机设计技术不需要物理模具即可创建内部架构，因此可作为转换工具，并具有较低的成本、更高的灵活性和效率，可以在微米级甚至纳米级上创建复杂的3D结构。3D 打印已经成为一项革命性技术，其起源可追溯到1984年Charles W. Hull的专利申请[10]，其描述了一种用于通过可光聚合流体的二维截面的重复图形化和叠加来构建三维物体的系统。3D 打印应用程序现在涵盖了广泛的领域，包括艺术、商业产品设计、大规模工业制造和建筑，以及最近应用于生物医学和生物应用程序等。

3D 打印技术是增材制造技术的一个子集，增材制造是通过将材料接合到3D模式中而形成物体的过程[11]。通常是通过2D的截面被增量地堆叠起来，形成一个3D图案结构。在过去的十年中，3D生物打印应用包括工程植入式组织支架[12]以及用于研究肿瘤干细胞、共培养组织模型和肿瘤微环境的体外组织支架[13]。对于所有的生物打印应用，其目标是控制细胞和生物材料进入组织样结构的模式。生物相容性是3D生物打印设计中最重要的考虑因素，这意味着材料、添加材料的方法以及材料的粘附机制（如热冷却和交联）必须对细胞无毒、无害。许多研究团队已经研发出了完全经人工组装的体外肿瘤3D模型，因此，将其转化为更具可重复性的增材生物制造平臺的时机已经成熟[14]。用于3D打印生物材料和细胞的主要技术有三种：喷墨生物打印技术、挤压生物打印技术和光辅助生物打印技术。

3 3D生物打印的材料及方法

3.1生物材料的选择  生物材料的选择是开发模拟天然细胞外基质的体外微环境模型的首要考虑因素之一。细胞与生物材料的相容性和聚合机制也影响生物材料的选择，3D生物打印方法的相容性进一步限制了可使用的生物材料的类型。目前已经开发了多种生物材料，包括为天然（胶原蛋白，明胶，透明质酸等），合成（聚乙二醇、聚异丙基丙烯酰胺等）及天然/合成混合材料，其均可用于通过3D生物打印制造3D体外支架。细胞侵袭及迁移是所有多细胞生物的一个正常过程，体外培养的细胞模型越接近体内微环境，越可以准确地模拟出肿瘤细胞的行为，但是合成基质的机械性能可以极大地改变肿瘤细胞行为，包括肿瘤干细胞分化、侵袭及迁移[15]。 为了使3D打印平台打印出的体外微环境与肿瘤细胞具有生物相容性，已对非生物材料中应用的打印系统和技术进行了修改，合成或改进天然材料的刚度可以通过控制聚合反应的条件来调节，使生物相容性材料最大程度地降低对细胞活力的任何潜在危害。

3.2基于喷墨和挤压成型的3D生物打印  生物打印系统的早期发展是通过喷墨打印机来打印细胞组件，这些组件可以在器官中模拟各自的结构，这是通过修改市售的喷墨打印机来实现的，这些喷墨打印机经过改良，可以输出蛋白质或细胞溶液，而不是墨水[16]。在过去的十年中，喷墨打印系统的进一步发展使其能够对由多种细胞类型组成的复杂且多元化的3D组织构造进行生物打印[17]。

在挤压和喷墨3D打印中，将生物材料、细胞和可溶性因子组成的生物墨水选择性地模压到表面形成3D支架。使用单一的生物墨水进行打印即可以生成具有建筑特色的结构，例如空心通道。扩展到两种或更多种生物墨水联用可以在空间上对生物基质材料和细胞进行图案化，从而可以创建具有结构特征性的体外模型。在典型材料挤压成型技术的3D打印中，通过挤压的方式迫使材料以受控的连续流方式通过喷嘴，将少量生物墨水沉积到平台上。该物料分配系统可以在x和y方向上自由移动，以2D模式将生物墨水物料沉积到支撑平台上，该平台同样还可以在z方向上移动，以设定的顺序添加到2D模式基础上，通过堆积的方式形成3D支架。基于此类挤压的3D生物打印已被用于制造类似血管的结构。

基于挤压成型的生物打印系统也得到了广泛的开发，以产生具有细胞样的生物结构。在首次将喷墨生物打印系统用于细胞应用之后，开发了一种带有凝胶沉积工具的机器人实现自由成形加工平台，以逐层沉积预种子海藻酸钠-水凝胶，以生产具有任意几何形状的三维预种子活体植入物。目前基于喷墨和挤压成型的生物打印已经用于创建仿生耳朵、肝脏、软骨和神经组织构造[18]。

喷墨和挤压成型的3D生物打印技术在简单性、灵活性和低成本方面具有独特的优势。但是，这两种方法也有局限性。首先，由于剪切应力和用于输送生物墨水的喷嘴的孔口直径小，存在细胞损伤和死亡以及细胞沉降和聚集。而且，打印分辨率受到喷嘴的物理条件限制，通常超过50 mm。此外，印刷结构的结构完整性是另一个障碍，尤其是在具有液滴和线条的界面上，由于生物材料的限制，特征的打印分辨率仅为200 μm[11，19]。

3.3基于光辅助的3D生物打印  除了基于喷墨和挤压成型的3D生物打印外，光辅助生物打印平台也越来越多地用于细胞打印和组织工程应用。这些主要涉及生物材料的光聚合反应，并可以打印出具有良好细胞生存力的各种细胞类型。光辅助3D生物打印系统分为两个子组：基于DLP的3D生物打印和基于激光的3D生物打印。

基于DLP的3D生物打印机是应用动态光学投影立体光刻（DOPsL）平台-利用由大约一百万个微镜组成的数字微镜器件芯片，并通过调制紫外光投射指定的光学图案到光聚合物溶液。该打印机的分辨率取决于每个微镜发出的光束的焦距，该焦距为微米级。与喷基于喷墨和挤压成型的3D生物打印相比，DLP打印机通过将光学图案的整个平面投影到光敏聚合物溶液上来并行3D打印，从而显著减少了制造所需的时间[20]。通过不断刷新的光学图形投影，并随着打印对象移动界面，可以打印出光滑的3D物体，并且通过消除界面伪影，可以大大提高打印的3D对象的机械完整性。由于这些优点，DOPsL系统已被用来创建各种复杂的3D结构，比如脉管系统网络和神经元导管[21]。

基于激光的3D生物打印的原理为其中激光束通过高倍物镜聚焦，在样品玻片上引发聚合或材料转移[22]。并结合样品台的三维运动，可以在亚微米分辨率下制备出复杂的3D结构，如用成纤维细胞和角质形成细胞替代的全细胞化的皮肤。

尽管光辅助3D生物打印具有许多优点，例如良好的生物相容性，高分辨率和高效率，但仍然存在一些需要解决的问题。首先，光辅助印刷的材料选择仅限于光敏聚合物，这会限制许多生物材料的使用，并且需要进行其他的化学修饰才能使材料光聚合。另外，由于没有喷嘴（用于喷墨打印机和挤出打印机）将材料输送到所需的制造区域，通常将光敏聚合物填充到整个容器中，在该容器中打印该3D对象，从而增加了浪费材料和增加成本的担忧。

4 3D生物打印在重建肿瘤微环境中的应用

如前所述，3D生物打印具有强大的改善体外模型的能力。3D打印应用使生物学家能够快速制作定制设计的3D支架原型，以在异质微环境中培养肿瘤细胞。而且人们逐渐地意识到，肿瘤微环境的异质性是推进体外癌症建模发展的关键。此外，细胞外基质的机械和化学成分的作用以及癌细胞和邻近基质细胞之间的相互作用为疾病进展和治疗靶点提供了新的视角[23]。3D生物打印可以在不同程度上解决所有这些问题，基于光辅助的3D生物打印可以绘制机械刚度的梯度图，可以用来检测细胞外基质对癌细胞局部侵袭的机械作用。基于喷墨和挤压成型的3D生物打印可以构建具有微米级分辨率的3D支架，而多光子发射技术将该范围扩展到纳米级特征图案化。多材料联合3D打印技术的发展，通过将细胞外基质样的生物材料、可溶性信号因子和细胞组成等多个生物墨水进行构图，此能力用来复制肿瘤微环境。这些生物墨水可用于形成可溶性或束缚生物活性分子的梯度，形成具有可控空間排列的细胞共培养模型以及具有复杂细胞外微环境组成的3D支架。

在体外环境中建立模型的确切特征上必须是离散的，这些细节也有助于指示或推荐3D生物打印方法，帮助人们实现所需的组织结构。通过为特定的研究定义最简单的3D模型系统，通过标准的假设驱动的研究将很容易发现癌症细胞的关键环境成因或调节因子。考虑到快速成型和控制支架生物活性信号特性的潜力，3D生物打印可用于实现这一目标。每一个变量都可以在高周转时间下进行操作和测试，以确定个体或组合对癌症细胞行为的影响。3D生物打印可重现中等到高通量的复杂体外模型，从而提高了筛选有助于转移性疾病发展的肿瘤微环境方面的能力。在肿瘤为转移性疾病的背景下，已知癌细胞会随着时间的推移明显改变行为，表现为肿瘤细胞侵入血液或淋巴管以及在继发性肿瘤部位进行定植和增殖。3D打印模型可以对变量进行4D操作，这非常重要，因为癌症是随时间和空间发展的疾病。3D打印模型可以控制4D模型，例如模式化的机械硬化或软化，生长因子从周围基质的定时和局部释放以及受控的灌注曲线向脉管系统的控制。所以，3D打印模型通过其模拟体内自然微环境的能力，并可以进一步促进人们了解肿瘤转移的机制。

目前尽管肿瘤治疗常用的化学治疗与放射治疗有一定的疗效，但目前很多研究表明化学治疗可能会诱导癌细胞发生突变释放，以及在细胞微环境中释放具有转移能力的细胞外囊泡来促进耐药性和转移行[24，25]。所以对于肿瘤治疗策略及新药筛选，在肿瘤干细胞影响的侵袭及迁移肿瘤模型中，筛选出可控制肿瘤微环境得新型抗癌药可能会有效治愈和缩小肿瘤[26]。而这一切的基础为先用3D生物打印模拟出最接近体内环境的肿瘤微环境，并制定成功的可持续发展的抗癌策略。

总之，3D生物打印具有动态模拟体内自然微环境的能力，3D打印模型可以进一步促进人们了解肿瘤转移的机制，可辅助体外筛选新型抗癌药;同时，个体化3D打印模型可辅助制定抗癌治疗策略。

5机遇与挑战

3D生物打印技术来确定肿瘤微环境及转移能力仍然存在局限性。首先，体外模型的主要困难之一是通常很难将体外细胞行为与体内细胞行为联系起来，这也是所有体外检测方法中的一个主要问题，3D生物打印确实提供了一种能力，能够较快速地提供多种具有变异性的支架。而且，为了更好地控制微体系结构的异质分布，对于大多数现有的生物打印机，需要将分辨率提高到亚细胞或分子水平（纳米级）。另外，由于生物材料充当与细胞的直接接触界面，需要扩展生物打印机与多种生物材料的生物相容性[27]。此外，缺乏商业合作资源使得非专业工程师难以采用3D生物打印来制作体外模型，非专业人士将来采用3D生物打印还会因难以学会并应用程序的标准化打印机而受到阻碍，加大了使用的限制。所以成功地将3D生物打印技术应用于主流临床工作需要工程师和癌症生物学家之间的跨学科研究。

6总结

3D生物打印技术已经为组织工程带来了惊人的成果，可能同样会改变对恶性肿瘤转移及复发的理解。3D生物打印技术能够大大提高构建复杂且可重现的体外肿瘤模型的能力，从而使肿瘤生物学家可以阐明目前尚不清楚的肿瘤微环境如何影响转移性疾病中的关键步骤。总之，对肿瘤微环境进行3D生物打印仍然需要来自多个领域的合作的努力，包括制造学、材料科学、生物学以及临床医学来应对机遇与挑战。

参考文献：

[1]Bray F，Ferlay J，Soerjomataram I，et al.Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA：A Cancer Journal for Clinicians，2018，68（6）：394-424.

[2]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015[J].CA：a Cancer Journal for Clinicians，2015，65（1）：5-29.

[3]Griffith LG，Swartz MA.Capturing complex 3D tissue physiology in vitro[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2006，7（3）：211.

[4]Yamada KM，Cukierman E.Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D[J].Cell，2007，130（4）：601-610.

[5]Zhang YS，Duchamp M，Oklu R，et al.Bioprinting the Cancer Microenvironment[J].ACS Biomater Sci Eng，2016，2（10）：1710-1721.

[6]Shen YI，Abaci HE，Krupski Y，et al.Hyaluronic acid hydrogel stiffness and oxygen tension affect cancer cell fate and endothelial sprouting[J].Biomaterials Science，2014，2（5）：655-665.

[7]Albritton JL，Miller JS.3D bioprinting：improving in vitro models of metastasis with heterogeneous tumor microenvironments[J].Disease Models&Mechanisms，2017，10（1）：3-14.

[8]Chaffer CL，Weinberg RA.A perspective on cancer cell metastasis[J].Science，2011，331（6024）：1559-1564.

[9]Mak IWY，Evaniew N，Ghert M.Lost in translation： animal models and clinical trials in cancer treatment[J].American Journal of Translational Research，2014，6（2）：114.

[10]Hull CW.Apparatus for production of three-dimensional objects by stereolithography：U.S.Patent 4，575，330[P].1986-3-11.

[11]Miller JS.The billion cell construct：will three-dimensional printing get us there[J]. PLoS Biology，2014，12（6）：e1001882.

[12]Sooppan R，Paulsen SJ，Han J，et al.In vivo anastomosis and perfusion of a three-dimensionally-printed construct containing microchannel networks[J].Tissue Engineering Part C：Methods，2015，22（1）：1-7.

[13]Kang HW，Lee SJ，Ko IK，et al.A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity[J].Nature Biotechnology，2016，34（3）：312.

[14]Loessner D，Meinert C，Kaemmerer E，et al.Functionalization，preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms[J].Nature Protocols，2016，11（4）：727.

[15]Chaudhuri O，Gu L，Darnell M，et al.Substrate stress relaxation regulates cell spreading[J].Nature communications，2015（6）：6365.

[16]Wilson JrWC，Boland T.Cell and organ printing 1：protein and cell printers[J].The Anatomical Record Part A，2003，272（2）：491-496.

[17]Xu T，Zhao W，Zhu J M，et al.Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology[J].Biomaterials，2013，34（1）：130-139.

[18]Pati F，Jang J，Ha DH，et al.Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink[J].Nature Communications，2014（5）：3935.

[19]Bhushan B，Caspers M.An overview of additive manufacturing（3D printing）for microfabrication[J].Microsystem Technologies，2017，23（4）：1117-1124.

[20]Zhang AP，Qu X，Soman P，et al.Rapid fabrication of complex 3D extracellular microenvironments by dynamic optical projection stereolithography[J].Advanced Materials，2012，24（31）：4266-4270.

[21]Zhu W，Ma X，Gou M，et al.3D printing of functional biomaterials for tissue engineering[J].Current Opinion In Biotechnology，2016（40）：103-112.

[22]Hribar KC，Soman P，Warner J，et al.Light-assisted direct-write of 3D functional biomaterials[J].Lab on a Chip，2014，14（2）：268-275.

[23]Schuessler TK，Chan XY，Chen HJ，et al.Biomimetic tissue-engineered systems for advancing cancer research：NCI strategic workshop report[J].Cancer Res，2014，74（19）：5359-5363.

[24]Keklikoglou I，Cianciaruso C，Gü？ E，et al.Chemotherapy elicits pro-metastatic extracellular vesicles in breast cancer models[J].Nat Cell Biol，2019，21（2）：190-202.

[25]Dzobo K.Taking a Full Snapshot of Cancer Biology：Deciphering the Tumor Microenvironment for Effective Cancer Therapy in the Oncology Clinic[J].OMICS，2020，24（4）：175-179.

[26]Dzobo K，Senthebane DA，Thomford NE，et al.Not Everyone Fits the Mold： Intratumor and Intertumor Heterogeneity and Innovative Cancer Drug Design and Developmen[J].OMICS，2018，22（1）：17-34.

[27]Malda J，Visser J，Melchels FP，et al.25th anniversary article：engineering hydrogels for biofabrication[J].Advanced Materials，2013，25（36）：5011-5028.

收稿日期：2020-07-02;修回日期：2020-07-16

編辑/成森