29份小麦种质资源抗条锈病分子检测

徐 熙，杨喜翠，徐如宏

(1.贵州省农业科学院 油料研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省农业机械技术推广总站，贵州 贵阳 550006；3.贵州大学，贵州 贵阳 550025)

小麦条锈病是一种由小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tririci)引起的气传性真菌类病害，具有变异程度高，流行程度广，降低小麦品质、产量的特点[1-3]。条锈菌对低温适应能力较强，不耐高温。前人研究表明，中国小麦条锈病5大越夏区为西北、四川西北、华北、云贵、新疆[4]。由于病原菌与寄主具有较高的协同进化能力，小麦品种在生产上使用3-5年便会丧失抗锈性，因此选育抗病品种是防治小麦条锈病最为安全，经济，有效的方法[5-6]。在小麦条锈抗病基因研究中，SSR技术被广泛应用于检测，标记，定位目的基因。目前已发现小麦抗条锈基因80多个，如Yr10，Yr15,Yr17,Yr19等，其中34个主效抗条锈基因已被正式命名，包括苗期抗病基因，成株期抗病基因，以及部分尚未明确的抗病基因[7]。陈尚安等[8]认为大多数已知小麦抗条锈基因来源于普通小麦，小部分源于小麦近源属(种)。Yr10源于小麦品种Moro,该抗病基因作为有效抗原在四川、贵州等地广泛应用，贵州高抗条锈小麦品种中，8.3%应用此抗源[9]。Yr15源于栽培二粒小麦(T.dicoccoidesG-25)，伍玲等[10]对96份四川省2004,2005年度在区试实验中被鉴定为高抗到免疫的小麦材料进行Yr15SSR分析标记检测，结果表明，11.1%的区试材料含有Yr15抗性标记带。Yr26来自圆锥小麦(T.turgidumL.)，西南地区和黄淮地区尤为依赖，在云贵地区推广品种如贵农775，贵农21，云麦52，川麦47等品种中均进行广泛应用[11]，2009年出现的小麦条锈菌新菌系V26对贵农22，含‘Moro’血缘品种，川麦42等小麦品种均具致病性[12]，抗病基因单一布局和病菌群体毒性组成变化的反复发生，是小麦条锈病品种选育中的关键问题。

小麦不仅是贵州主要粮食作物之一，而且是唯一的冬季粮食作物，常年面积在45万hm2左右，仅次于水稻、玉米[12]。贵州省地处云贵高原，夜间冷凉，条锈病生理小种变异速度较快。受冬季温度偏高、田间湿度大等因素影响，2017年贵州条锈病发病范围广，程度重[13]，对小麦的优质高产造成危害。本研究以贵州大学麦作研究中心选育和引进小麦资源为材料，经在田间进行条锈抗性鉴定，进行条锈病相关的Yr10，Yr15，Yr26抗性基因的分子标记检测，探索和阐明这些材料携带的抗性基因，为合理配合抗性品种，有效利用抗病基因和抗病材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 小麦种质材料由贵州大学麦作研究中心、中农业科学院作物研究所提供

小麦种质种植于贵州省麦作中心，在自然诱发条件、条锈病充分发病后，于2017年4月下旬进行田间鉴定，按国家标准《小麦条锈病测报调查规范(GB/T15795-1995)》观察记录小麦种质对条锈病的反应型，选取29份小麦种质作为供试材料，以高感条锈病材料辉县红为阴性对照。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

取6月中旬田间麦苗抗病植株灌浆种子，用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-03)进行小麦基因组总DNA的提取。

1.2.2 PCR检测

选取Yr10、Yr15、Yr26，共3个连锁分子标记对所测的29份小麦材料进行SSR检测。PCR扩增反应体系为20μl，10×buffer(500mmol/LKCL)2μl;25mmol/LMgCl21.6μl；2.5mmol/LdNTP0.4μl;5mmol/Lprimer各1μl;50ng/μl DNA模板2μl；2.5U/μlTagDNA聚合酶0.5μl；ddH2O11.5μl。

反应程序：预变性(95℃ ，5min)，变性(95℃，45s),退火(50～60℃，45s),延伸:(72℃，60s)。反应程序为35个循环；延伸(72℃，10min)。获取PCR产物后，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳银染。

2 结果与分析

2.1 Yr10分子检测

邵应田等[14]利用AFLP标记技术发现，在具有Yr10基因的抗病材料中可扩增出SC200、SC180两条带，SC200为特异带且与Yr10抗病基因紧密连锁，SC180则为非特异条带，在所有供试材料中皆有出现。由表1可知，阴性对照品种辉县红检测到210和180，29份供试材料中,周麦检测到180bpt、200bp、210bp显示条带，表明周麦中有含Yr10的连锁标记，且可能具有Yr10抗病基因。贵农19只检测到180bp一条带，贵农30，贵农18，贵紫1号等已审定的品种及剩余材料皆检测180bp和210bp两条非特异条带，表明这些材料中不含Yr10的连锁标记，不含Yr10基因。

表1 抗性基因连锁标记和引物序列

图1 小麦抗条锈病基因Yr10连锁标记SC200的检测

2.2 Yr15分子检测

李奇峰等[15-16]通过SSR分子检测表明,Yr15的引物Xbarc8可扩增200bp的抗病标记带。由图2、表2可知贵农19，小黑麦，丰优8号， 13-2-10中检测出200bp条带，说明这些材料中含有Yr15连锁标记，可能含有Yr15抗病基因。在贵农19，中燕亲本中检测到300bp条带，,1051,1073，1210，贵农30中等材料中皆出现290bp条带，说明这种材料未含Yr15连锁标记，不含Yr15基因。

图2 小麦抗条锈病基因Yr15连锁标记Xbarc8的检测

2.3 Yr26分子检测

万江华等[9,17-18]以内麦9号为阳性对照，以Xgwm11为引物，检测到长度为215bp及193bp的条带，本研究标为“1”型；阴性对照品种绵阳26则检测到长度和225bp和203bp,本研究标为“0”型。当引物为Xgwm181时，阳性品种即可检测出195bp，阴性品种则与绵阳26带型相同，片段大小为180bp。由图3A，表2可知1052,1051，中燕亲本等18份材料皆检测出“1”型条带。 其他材料检测带型为“0”,少数几个材料未出现目标条带。以Xgwm181为引物，由图3B,表2可知，1051，1061，中燕亲本，贵紫1号等13份材料皆检测除195bp目标带，剩余材料则出现180bp条带。由图3，表2可知，1210，小黑麦，石无芒1号，10无芒4份材料同时检测出“1”带型和195bp标记带，说明这些材料含有Yr26连锁标记，可能含有Yr26抗病基因。

图3 小麦抗条锈病基因Yr26连锁标记Xgwm11(A),Xbarc181(B)的检测

表2 29份小麦Yr10、Yr15、Yr26分子检测及田间鉴定

辉县红0000高感中燕亲本0001高抗12100011高抗贵紫1号00-1中抗贵农19(无芒)01-1高抗贵农300000高感小黑麦0111高抗周麦1010高抗加拿大-10000中抗丰优8号01-0高抗13-2-1001-0高抗贵农18选曹7-8-40-00高抗石无芒1号0011高抗贵农10-800-0高抗贵紫4号0011高抗10无芒0000高抗

3 讨论

3.1 抗性标记与抗性基因检测的关系

贵州作为小麦条锈病越夏区之一，开展抗病品种的筛选、选育及推广，在育种过程中聚合抗条锈基因，是保证小麦稳产增产较为经济有效的手段。结合前人研究，SC200紧密连锁Yr10抗条锈病基因，在 Yr10的检测中广泛应用[14,16]。试验结果表明，周麦中可能含有Yr10抗病基因，这与张玉薇[19]的研究结果相同。29份供试材料中，检测出180bp非抗性基因标记条带，除贵农19外，其他所选试验材料均检测出210bp条带，该结果可能由于大部分供试材料遗传背景中不含有Moro,田间表现优秀或许是由于含有其他抗病基因。自Mcintosh[20]等将Yr15基因定位于1B染色体短臂后，Yr15在四倍体和六倍体小麦中大量应用。检测结果表明，13.79%的材料可能含有Yr15连锁标记，其他材料则不含Yr15抗病基因。由于Yr15为全生育期抗条锈基因，部分材料虽田间鉴定表现中抗或高抗，但不含Yr15抗病基因,该结果可能是由于含有其他基因导致抗病表现。Yr26基因位于小麦1B染色体上，作为抗源广泛应用于我国主栽品种中。本研究同时使用Xgwm11和Xbarc181两个位于主基因两侧的连锁标记检测Yr26基因，以提高分子检测的准确性[6]。本次检测中55.17%的材料可能含有Yr26,说明Yr26作为条锈抗源仍然广泛使用于生产品种中。

3.2 小麦种质中Yr10、Yr15、Yr2抗病基因分布及利用

检测结果表明，供试的29份小麦种质材料中，可能含有Yr10、Yr15、Yr26，各基因分别占总材料的3.44%，13.79%，55.17%，周麦同时含Yr10和Yr26，贵农19(无芒)和小黑麦两份材料同时含有Yr15和Yr26，超过一半的供试材料含有Yr26基因。王凤乐[21]研究发现，Yr10对优势生理小种条中30和条中31表现免疫，张玉薇对我国国审小麦品种检测发现含Yr10小麦品种主要分布在河南及北方地区，西南地区利用较少。本次对Yr10的检测结果与张玉薇研究结果相同，贵州品系中未发现含有含有Yr10的品种，携带Yr10的周麦属于河南小麦品种。贵农系是携带Yr26的代表品种[22]，作为遗传背景广泛应用于生产品种中。陈天青等[21]通过对抗病位点PCoA分析发现，贵州小麦抗病品系中，绝大多数含有Yr26基因位点，Yr9则相对较低。本次检测印证了陈天青的研究结果。变异小种V26会使携带Yr26、Yr10的小麦品种抗性丧失，对Yr9则不会造成威胁，在今后的育种工作中，应注重Yr26与Yr9的聚合，预防V26在贵州小麦抗病品种中的蔓延。

贵农10-8，贵农18选曹7-8-4，虽属贵农背景，却未检测出Yr26基因，且田间表现良好，可能含有其他抗病基因,应加强对此类品种的培育。张立异等[23-24]研究表明西南冬麦区小麦品系中有27.1%携带1BL/1RS异位系片段，而北方、黄淮冬麦区小麦品系中1BL/1RS异位系占46%和57%。1BL/1RS异位系不仅对小麦条锈病抗病性好，而且适应性强，在合理利用的同时减少其对小麦品质的影响，丰富贵州品系抗条锈基因，增加遗传多样性。四川发现的新菌G22-9和G22-14对Yr10和Yr26具有联合毒性[2]，潜在流行小种CH42等对Yr24/26有致病性。陈天青研究表明，140份西南地区小麦品种未携带Yr15,两份材料为Yr10+Yr26的双基因组合，Yr10、Yr15 在西南地区利用频率较低。本次检测中，双基因组合为Yr10+Yr26(1份)、Yr15+Yr26(2份)，该结果与陈天青部分结果一致，此外，贵州品系中Yr15+Yr26双基因组合的出现说明近年来贵州育种工作者对Yr15利用的重视。育种工作者应谨慎选择亲本，聚合多种抗条锈基因，开发引进抗病基因，对已培育出的品种加以改良，培育联合抗病品种，延缓品种抗性。对抗条锈病基因进行合理布局，预防抗性丧失，保障小麦生产安全。