咪唑立宾结晶工艺研究

程曜峰，冷 凤，孙丙林，张 炜*，张雪霞*

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015； 2.华北制药集团华胜有限责任公司，河北 石家庄 050015)

咪唑立宾(Mizoribine，MZR)，商品名为布累迪宁，是1971年从真菌Eupenicilliumbrefedianum的培养液中分离得到的一种咪唑类核苷[1]，其分子式为C9H13N3O6，化学名为5-羟基-1-β-D-呋喃糖基-1H咪唑-4-羧酸胺，呈白色或微带黄色的结晶粉末[2]。咪唑立宾早期作为抗真菌药物开发，后期研究发现其具有免疫抑制效应和抗肿瘤作用[3]。咪唑立宾作为兼抗肿瘤和抗排斥双重特性的免疫抑制剂，临床多应用于肾移植术后患者的治疗，在降低排斥反应发生的同时，预防、治疗肾移植术后恶性肿瘤，从而提高肾移植术后患者的长期存活率[4]。相比于其它免疫抑制剂，咪唑立宾还具有骨髓抑制作用弱、消化系统不良反应小等优点[5]。此外，咪唑立宾临床上也可用于治疗狼疮性肾炎、类风湿性关节炎[6]及肾病综合征[7]等自身免疫性疾病。

咪唑立宾主要通过发酵法生产，其发酵产物经过滤、提取、精制、脱色、结晶等过程得到产品。传统的生产工艺所得产品多为咪唑立宾一水合物，该化合物性质不稳定，不便于储存和运输。为提高咪唑立宾的稳定性，专利[8]公开了一种将咪唑立宾一水合物加入到乙醇中加热回流制备无水咪唑立宾的方法，所得无水咪唑立宾的性质稳定。但该方法所得产品晶粒细小，制剂分装困难，不利于工业生产。鉴于此，作者对咪唑立宾的结晶工艺进行优化，探究抗溶剂种类、溶液初始浓度、抗溶剂滴加速度及抗溶剂加量对咪唑立宾结晶纯度、堆密度、收率和产品稳定性的影响。

1 实验

1.1 试剂与仪器

咪唑立宾粗品(纯度85%)，华北制药集团华胜有限责任公司；甲醇、乙醇、丙酮，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

高效液相色谱仪(SPD-M20A 型紫外检测器，LC-20AT型泵，SIL-20A型自动进样器，CTO-10AS型柱温箱)，日本Shimadzu公司；OptiMax 1001型结晶器(反应釜 500 mL)， Mettler-Toledo公司；Leica DM500-ICC50型显微镜。

1.2 方法

将咪唑立宾粗品溶解于一定体积、一定温度的纯化水中制成溶液，以不同滴加速度加入一定量抗溶剂，抗溶剂加量为水溶液体积的8～12倍；加料结束后养晶3～6 h，过滤，用抗溶剂洗涤滤饼，干燥，即得咪唑立宾结晶产品。

对咪唑立宾结晶过程中抗溶剂种类、溶液初始浓度、抗溶剂滴加速度及抗溶剂加量进行优化，以提高咪唑立宾结晶纯度、堆密度和收率。

2 结果与讨论

2.1 结晶工艺优化

2.1.1 抗溶剂种类选择

配制浓度为0.5 g·mL-1的咪唑立宾水溶液，分别以甲醇、乙醇、丙酮为抗溶剂进行结晶，抗溶剂加量为咪唑立宾水溶液体积的10倍，滴加速度为6 BV·h-1，滴加完毕后养晶4 h，考察抗溶剂种类对结晶效果的影响，结果见表1。

表1 抗溶剂种类对结晶效果的影响

由表1可知，使用3种抗溶剂均可以得到结晶产品。综合考虑，以乙醇为抗溶剂时，结晶产品可获得更好的纯度、堆密度和收率。

2.1.2 溶液初始浓度和抗溶剂滴加速度选择

在结晶过程中，抗溶剂加量过大会形成超过饱和微环境，容易引发爆发成核，致使晶体细小、晶体团聚、溶剂和杂质包容在晶簇中，从而影响产品质量。降低体系初始浓度可以降低局部的过饱和度，减少爆发成核带来的负面影响；而过低的初始浓度不仅会增大抗溶剂的消耗量，也会导致收率下降。因此，寻找恰当的初始浓度是控制抗溶剂结晶过程的关键之一。

抗溶剂与结晶液的快速混合有利于迅速降低局部的过饱和度，减少爆发成核的发生率。在结晶设备参数固定的情况下，抗溶剂滴加速度是影响溶剂混合的关键。对溶液初始浓度和抗溶剂滴加速度两个参数组合进行优化，结果见表2。

表2 溶液初始浓度和抗溶剂滴加速度对结晶效果的影响

由表2可知，溶液初始浓度高、抗溶剂滴加速度快时收率较高，但纯度和堆密度呈下降的趋势。咪唑立宾产品质量要求纯度尽量高，堆密度尽量大。从生产成本控制方面考虑，收率应尽量高一些。综合考虑，在满足质量指标要求的前提下，选择溶液初始浓度为0.7 g·mL-1，抗溶剂滴加速度为5 BV·h-1。

2.1.3 抗溶剂加量选择

在溶液初始浓度为0.7 g·mL-1、抗溶剂滴加速度为5 BV·h-1的条件下，分别采用8 BV、10 BV、12 BV的抗溶剂加量进行结晶实验，结果见表3。

表3 抗溶剂加量对结晶效果的影响

由表3可知，抗溶剂加量主要影响产品收率，对纯度和堆密度影响较小。综合考虑原材料的成本与产品收率，选择抗溶剂加量为12 BV最为经济。

2.2 优化工艺放大验证

在优化工艺条件下进行了3批工业规模的生产工艺验证。称取14 kg咪唑立宾粗品溶解于20 L纯化水中，配制浓度为0.7 g·mL-1的咪唑立宾水溶液。以工业乙醇为抗溶剂，抗溶剂加量为咪唑立宾水溶液体积的12倍，滴加速度为5 BV·h-1，滴加完毕后养晶4 h，过滤、洗涤、干燥得咪唑立宾结晶产品，结果见表4。

表4 咪唑立宾结晶工艺验证结果

生产工艺验证所得咪唑立宾晶体与重结晶前咪唑立宾晶体相比，晶体外观发生明显变化，由重结晶前的块状晶体变为针状晶体(图1)。

图1 咪唑立宾重结晶前(a)后(b)晶体的显微照片

最佳工艺条件下生产放大所得结晶产品的室温长期稳定性检测结果见表5。

表5 室温长期稳定性检测结果

由表5可知，生产放大所得结晶产品室温存放36个月，纯度仍达到99.6%，仅下降0.2%，表明结晶产品可长期存放，稳定性好。

优化的咪唑立宾粗品结晶工艺操作简单、结晶收率高，所制备的产品纯度高、堆密度较大、稳定性好，可满足制剂工艺要求。

3 结论

对咪唑立宾的结晶工艺进行优化，探究了抗溶剂种类、溶液初始浓度、抗溶剂滴加速度及抗溶剂加量对咪唑立宾结晶纯度、堆密度、收率和产品稳定性的影响。确定最佳结晶工艺为：以乙醇为抗溶剂、溶液初始浓度0.7 g·mL-1、抗溶剂滴加速度5 BV·h-1、抗溶剂加量为咪唑立宾水溶液体积的12倍(12 BV)。该结晶工艺所得产品纯度高、杂质少、堆密度较大、稳定性好，适合工业化生产，有利于长期储存和制剂分装，对此类药品的工业结晶有较好的应用价值。