尤瑞克林对局灶性脑梗死大鼠Slit2/Robo1表达的影响

刘海燕 钱 琪 郑献召 吕海东

焦作市人民医院神经内科，焦作，454000，中国

挽救半暗带和阻止梗死中心区的进一步扩大可以有效减轻缺血性脑梗死后神经功能缺损，而梗死后治疗性血管新生能及时恢复血供、重建侧支循环，达到神经保护的作用。Slit/Robo 信号通路在轴突迁移［1］、白细胞募集［2-3］、肌细胞定位［4］等过程中都发挥排斥性或吸引性的导向作用，并在胚胎血管和肿瘤血管发生［5］中发挥重要作用，提示了Slit/Robo 信号通路对于机体可能存在一致的细胞导向作用［6］，并可能参与调控脑梗死后血管新生过程中内皮细胞等的定向迁移。作为治疗急性脑梗死的一类新药，尤瑞克林能通过内皮释放一氧化氮（nitric oxide，NO），扩张细小动脉，促进血管新生。然而尤瑞克林是否在促血管新生过程中，作用于Slit/Robo 信号通路尚不清楚，故本课题结合急性脑梗死后Slit/Robo 的表达变化和尤瑞克林的促血管新生作用，探讨脑梗死后血管新生过程中Slit/Robo 信号通路和尤瑞克林的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年健康SD 大鼠54 只，♂，体质量：（250～300）g，由河南省动物中心提供（合格证号SCXK（豫）2010-0002）。随机分为假手术组、模型组、尤瑞克林组，再根据梗死后缺血时间分为1、3、7 d 三个亚组，每组6 只。尤瑞克林组给予尤瑞克林：17.5×10-3U·kg-1·d-1；模型组给予等体积生理盐水。

1.2 药物和试剂

尤瑞克林，由广东天普生化医药股份有限公司提供，粉针剂，规格为0.15 PNAU/支。Anti-Slit2 兔多抗、Anti-eNOS 兔多抗，均购自Santa Cruz 公司。RT-PCR试剂盒，购自Transgene 公司，引物由上海生工生物公司合成。

1.3 模型制备

采用改良Longa 法［7］建立永久性大脑中动脉梗死动物模型（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）。10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，颈部正中切口，分离至颈前肌肉，向左前方找到颈动脉鞘，依次分离出颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。夹闭ICA，结扎ECA 和CCA，在颈总动脉分叉处下方再置一手术缝线并打活结，用于结扎线栓。在结扎线和活结之间剪一斜形小口，插入线栓，松开动脉夹，沿ICA 继续插入线栓，直至轻插遇阻力且标记处距分叉约2 mm 处，固定线栓至皮下，缝合皮肤。术后保暖直至麻醉苏醒。术后观察大鼠行为，并根据Longa［7］神经功能评分标准进行评分。纳入标准：1～3 分，且排除其他因素。剔除标准：0 和4 分，并采用相同造模方法予以补充。假手术组不结扎不插线栓，余步骤相同。

1.4 Western-blot

提取总蛋白：剪碎脑组织后加入裂解液，匀浆后裂解30 min，4 ℃离心5 min，取上清。检测蛋白浓度。取80 μL 样品和20 μL 5×SDS 上样缓冲液，混匀后加热变性，灌胶上样。每孔上样量约20 μL，进行SDS-PAGE 凝胶电泳。转膜至PVDF 膜上，100 V 恒压80 min。5%脱脂奶粉封闭2 小时，孵一抗，4℃过夜，TBST 漂洗3 次后孵二抗。漂洗后ECL 显色，胶片扫描，以GAPDH 为内参，用Bandscan5.0 软件进行灰度分析。

1.5 RT-PCR

登陆Genbank 获得Robo1 序列，以GAPDH 为内参照，设计特异性引物序列：Robo1：上游5′GG AGGAGTTCAGTGAAGAA3′，下游5′ TGGTGGCATC TAGGTTTTG3′（309 bp）；GAPDH：上游5′TCAACGGCA CAGTCAAGG 3′，下游5′ CAGATCCACAACGGATACA3′（569 bp）。脑组织匀浆后加入Trizol 和氯仿提取总RNA，全程避免RNase 污染，逆转录合成cDNA，PCR扩增（反应条件：94 ℃预变性2 min，1 个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环）。2%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像分析系统对条带进行分析，计算DNA 条带相对GAPDH 的灰度值比值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 MCAO 模型制作结果

造模前大鼠活动自由。术后大鼠提尾悬空实验阳性（右侧前肢屈曲不伸展）。身体偏向右侧，或向右侧转圈，侧推抵抗力下降。提示大鼠左侧大脑神经功能缺损，造模成功。

2.2 Western 印迹结果

模型组和尤瑞克林组Slit2 蛋白在术后1～7 d 表达逐渐升高；模型组和尤瑞克林组各时间点Slit2 蛋白表达较假手术组均升高，尤瑞克林组各时间点Slit2 蛋白表达较模型组均升高（F=179.918，654.526，772.902，P＜0.05）（Tab.1）。模型组和尤瑞克林组内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在术后1～7 d 表达逐渐升高；模型组和尤瑞克林组各时间点eNOS 表达较假手术组均升高，尤瑞克林组各时间点eNOS 表达升高程度较模型组显著，差异有统计学意义（F=137.500，328.011，1 923.814，P＜0.05）（Tab.2）。经Pearson 相关分析发现，术后1 d、3 d、7 d Slit2 蛋白表达强度和eNOS 表达强度呈显著正相关（r=0.987，0.928，0.979，P＜0.01）（Fig.1）。

Tab.1 Expression of Slit2 in rat brain tissues at different time points（）

Tab.1 Expression of Slit2 in rat brain tissues at different time points（）

Note：*P ＜0.05 vs the sham operation group，ΔP ＜0.05 vs the model group.

Tab.2 Expression of eNOS in rat brain tissues at different time points（）

Tab.2 Expression of eNOS in rat brain tissues at different time points（）

Note：*P ＜0.05 vs the sham operation group.ΔP ＜0.05 vs the model group.

2.3 RT-PCR 结果

与假手术组比较，模型组和尤瑞克林组Robo1 mRNA 在各时间点均低于假手术大鼠模型，术后1 d表达明显下降，之后逐渐升高，但仍较假手术组有所降低，7 d 仍未达到正常水平。与模型组比较，尤瑞克林组Robo1 mRNA 表达在各时间点均高于模型组（χ2=1 213.567，704.513，35.110，P＜0.05）（Tab.3、Fig.2）。

Tab.3 Levels of Robo1 mRNA in rat brain tissues at different time-points（）

Tab.3 Levels of Robo1 mRNA in rat brain tissues at different time-points（）

Note：*P ＜0.05 vs the sham operation group.ΔP ＜0.05 vs the model group score.

Fig.1 Relation chart of the expression of Slit2 and eNOS in rat brain tissues at different time points

Fig.2 Expression of Robo1 mRNA in rat brain tissues at different time-points

3 讨论

Slit 蛋白作为神经导向因子家族的一员，最先在果蝇中枢系统中线细胞被发现，它在胚胎发育过程中，排斥性地导向轴突生长锥的伸展方向，避免突触跨越大脑中线［8］。作为智障相关因子，Slit 在中枢神经系统发育过程中发挥重要作用。在外周神经损伤模型中，Slit蛋白及其受体Robo 和下游信号分子分泌增加，揭示了Slit 蛋白能促进外周神经轴突再生［9-11］。在脑缺血模型中，Altay 等［2］证实Slit2 蛋白能排斥脑缺血和肿瘤坏死因子所致的白细胞的募集，首个提出Slit2 蛋白通过抑制炎性反应发挥神经保护作用。近期学者［9］通过小鼠模型发现成神经细胞通过Slit/Robo 通路迁移至脑中风后的病灶，并有效促进再生神经。在血管新生方面，Slit2 能促进内皮细胞的迁移［12-13］，诱导人脐静脉内皮细胞在细胞外基质中重建血管网络，Wang［6］和Jiang［14］等阐述了Slit/Robo 在肿瘤血管新生中的促进作用，且利用Robo-N 能阻断该信号通路的作用。并且Slit2 可能通过上调Robo1 和激活VEGFR2-ERK1/2 途径来促进视网膜血管生成［15］。在大脑组织的血管新生方面，Han［16］等发现，在其构建的Slit2 转基因小鼠模型中，大脑血管密度和渗透性显著增加。目前，Slit/Robo 信号通路在大脑梗死后血管新生过程中的具体作用机制［15］尚未明确。

本课题通过检测Slit/Robo 信号通路主要分子，发现脑梗死发生后，Slit2 蛋白表达持续升高，说明脑组织通过升高表达Slit2 蛋白，增强Slit/Robo 信号通路的作用，来发挥其神经保护作用。同时，本研究结果发现Slit2 蛋白的表达趋势与eNOS 的表达高度正相关，从另一方面提示了Slit2 很可能协同eNOS 在血管新生的过程中发挥重要作用，但具体机制仍需进一步研究。

Robo1 mRNA 在梗死后早期急剧下降，考虑与细胞受损和Robo1 介导炎性细胞渗透［17］相关，梗死后3 d，Robo1 mRNA 表达逐渐升高，在7 d 接近正常水平，但仍低于正常大鼠水平，提示在梗死发生后，Robo1 早期降低抑制炎症反应，而随着大脑缺血缺氧时间的延长和炎性反应的缓和，逐渐加强其在内皮细胞迁移和血管成管方面的作用，而这种作用正是升高的Slit2 蛋白介导的。

尤瑞克林是一种由人尿中提取的组织激肽原酶，能裂解激肽原为激肽，提高胞内Ca2+的流动，直接增强内皮细胞上eNOS 的活性；同时也能超激活血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的受体［18］，并通过PI3K-Akt-GSK-3β［19］途径提高eNOS活性，从而扩张血管，促进血管再生。本课题应用尤瑞克林干预MCAO 模型大鼠，使eNOS 表达明显升高，提示尤瑞克林明显启动并增强了缺血部位的血管新生过程，从而提高该区的微血管密度，促进侧支循环的形成。在干预过程中，伴随着eNOS 的升高，Slit2 及其受体的表达也明显升高，于是，从另一方面提示了Slit2/Robo1 可能参与大鼠脑组织缺血后的血管新生过程。同时，也提示在复杂的血管新生过程中，尤瑞克林可能通过激活Slit/Robo 通路，发挥其促进血管新生作用。