高效液相色谱法测定蓝莓酵素酒中山梨酸和糖精钠含量的不确定度评定

周楠 丁红梅 杨俊

[摘要]依据《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）及《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）中不确定度评定的一般流程，对高效液相色谱法测定蓝莓酵素酒中山梨酸和糖精钠含量测量不确定度进行评定。通过建立相应的数学模型，分析高效液相色谱法测定蓝莓酵素酒中山梨酸和糖精钠含量测量中引入的各测量不确定度分量，计算得到测量结果的合成标准不确定度和扩展不确定度。当置信度为95%，包含因子为2时，得到测量结果山梨酸扩展不确定度为0.007 6g/kg，样品中山梨酸含量表示为（0.169 5±0.007 6）g/kg;糖精钠扩展不确定度为0.004 9g/kg，含量测定结果可表示为（0.138 0±0.004 9）g/kg。评定结果表明，影响检测结果不确定度的因素主要是标准工作溶液配制和仪器重复测定。本方法对高效液相色谱法测定蓝莓酒中山梨酸和糖精钠含量结果的不确定度评定具有参考作用。

[关键词]不确定度;山梨酸;糖精钠;高效液相色谱法;蓝莓酵素酒

中图分类号：TS275.4 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202008

食品添加剂作为现代食品工业重要组成部分，对于改善食品色、香、味、形，提高食品的质量和档次，防止腐败变质发挥着重要的作用[1]。但食品添加剂在食品加工环节超限量或者违规使用会对人体健康造成潜在危害[2]。山梨酸是一种国际公认安全的防腐剂，安全性很高，但如果山梨酸的添加量超标，消费者长期食用，在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康[3]。糖精钠作为甜味剂甜度约为蔗糖的450～550倍，食用较多后，会影响肠胃消化酶的正常分泌，降低小肠的吸收能力，使食欲减退，有致癌和致遗传损害的可能性[4-5]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定山梨酸及其钾盐与糖精钠在配制酒的最大允许使用量分别为0.4g/kg、0.15g/kg[6]。2011年中国合格评定国家认可委员会颁布的《测量不确定度的要求》（CNAS-CL07）指出：当不确定度与检测结果的有效性或应用有关、或在用户有要求时、或当不确定度影响到对规范限度的符合性时、当测试方法中有规定时和CNAS有要求时，检测报告必须提供测量结果的不确定度。故测量不确定度的评定对实验室检测的准确表示和评定具有重要意义[7]。本文参照《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[8]及《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[9]，建立测量模型，对其进行不确定度来源分析和评定，为同类项目的测定结果的不确定度评定及分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蓝莓酵素酒：市售;乙酸铵：分析纯，国药集团有限公司;甲醇：色谱纯，德国Merck公司;山梨酸标准品：CAS 110-44-1，纯度99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司;糖精钠标准品：CAS 128-44-9，纯度99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司;高效液相色谱仪：Agilent 1260，安捷伦科技（中国）有限公司;电子天平：BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司;离心机：eppendorf 5430，德国艾本德股份公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于8 000r/min离心5min，将水相转移至50mL容量瓶中，于残渣中加水20mL，涡旋混匀后超声5min，于8 000r/min离心5min，将水相转移到同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22μm滤膜，待液相色谱测定。

1.2.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制：分别准确移取山梨酸标准品（1 000μg/mL）和糖精钠标准品（1 000μg/mL）各1.0mL于10mL容量瓶中配制混合标准储备液（100μg/mL）。逐步稀释得到标准工作液质量浓度分别为1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Shiseido Solar C18柱（150mm×4.6mm，0.5μm）;流动相：0.02mol/L 乙酸铵溶液-甲醇（95∶5，v/v）;流速：1mL/min;进样量：10μL。

2 不确定度评定

2.1 数学模型的建立

山梨酸、糖精钠的含量计算公式：

X=（c×v）÷（m×1 000）                                    （1）

式中：X为试样中待测组分含量，g/kg;c为由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，mg/L;v为试样定容体积，mL;m为试样质量，g。1 000是由mg/kg转换为g/kg的换算因子。

2.2 不确定度主要来源及分析

分析测定的整个过程和数学模型，不确定度主要来源如下：

（1）称量样品质量产生的不确定度u（m），主要包括天平校准引入u1（m）、样品重复称量引入不确定度u2（m）。（2）样品处理液定容体积产生的不确定度u（v），主要包括温度变化引入不确定度u1（v）、容量瓶检定引入的不确定度u2（v）。（3）标准工作曲线产生的不确定度u（c）：①标准溶液制备产生的不确定度u1（c），包括标准物质引入的不确定度u2（c）、量器引入不确定度u3（c），u3（c）又包括量器校准引入的不确定度u4（c）和温度变化引入的不确定度和u5（c）;②曲线拟合产生的不确定度u6（c）。（4）仪器重復测量样品产生的不确定度u（f），包括仪器校准引入的不确定度u1（f）和重复测量引入的不确定度u2（f）。

由于以上各不确定度分量互不相关，所以其合成相对标准不确定度如下：

urel（X）=[urel（m）2+urel（v）2+urel（c）2+urel（f）2]        （2）

3 各分量标准不确定度的评定

3.1 称量样品引入的不确定度u（m）

3.1.1 由天平校准产生的不确定度

天平校准证书上允许的极差为±0.1mg，按照均匀分布考虑，包含因子k=3，因此计算标准不确定度u1（m）=0.1÷3 =5.77×10-2mg。

称量需进行二次（一次清除称量容器质量，一次称量样品质量），则二次称量的标准不确定度U1（m）=[2×（0.1÷3  ）2 ]  =0.081 65mg，相对标准不确定度u1rel（m）=U1（m）÷m=0.081 65÷（2.011 0× 1 000）=4.060 2×10-5。

3.1.2 重复称量产生的不确定度

根据检定证书，天平的重复性误差为0.2mg，按照均匀分布考虑，包含因子k=3，因此计算标准不确定度U2（m）=[2×（0.2÷3  ）2]  =0.163 30mg，相对标准不确定度u2rel（m）=U2（m）÷m=0.163 30÷（2.011 0 × 1 000）=8.120 3×10-5。

3.1.3 样品称量产生的不确定度

天平称量产生的相对标准不确定度urel（m）=[u1rel（m）2+u2rel（m）2] =[（4.060 2×10-5）2+（8.120 3 × 10-5）2]=9.079×10-5。

3.2 定容样品引入的不确定度u（v）

3.2.1 温度变化引入的不确定度

样品处理液最终定容在50mL容量瓶中，容量瓶在20℃下检定，当实验室温度变化为±5℃时，代入水和玻璃的膨胀系数，水的膨胀系数为2.1×10-4mL/℃，而玻璃的膨胀系数为水的膨胀系数的   ，所以忽略不计。按照均匀分布，k=3，则U1（v）=（50×5×2.1×10-4） ÷3  =0.030 31mL，u1rel（v）= U1（v）÷v=6.062 4×10-4。

3.2.2 检定引入的不确定度

根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[10]，A级的50mL单标线容量瓶的允差为±0.05mL，按照均匀分布考虑，包含因子k=3，则标准不确定度U2（v）=0.05÷3=0.028 87mL，相对标准不确定度u2rel（v）=U2（v）÷v= 5.774 0×10-4。

3.2.3 由定容体积引入的标准不确定度

样品定容体积的标准不确定度urel（v）=[u1rel（v）2+u2rel（v）2]=[（6.062 4×10-4）2+（5.774 0× 10-4）2] =8.372×10-4。

3.3 标准工作曲线引入的不确定度u（c）

3.3.1 标准溶液配制产生的不确定度

标准溶液配制产生的不确定度u1（c）包括标准物质引入的不确定度u2（c）、量器引入不确定度u3（c），其计算公式如下：

u1rel（c）=[u2rel（c）2+u3rel（c）2]                                 （3）

3.3.1.1 山梨酸标准储备液、糖精钠标准储备液产生的不确定度

山梨酸标准溶液（1 000μg/mL）和糖精钠标准溶液（1 000μg/mL）证书中提供的扩展标准不确定度为3%和2%，按正态分布置信概率P=95%，包含因子k=2。使用山梨酸标准溶液产生相对标准不确定度为u2rel（山梨酸）=3%÷2=0.015。使用糖精钠标准溶液产生相对标准不确定度为u2rel（糖精钠）=2%÷2=0.01。

3.3.1.2 标准储备液稀释过程中量器引入的不确定度

量器引入不确定度u3（c）包括量器校准引入的不确定度u4（c）和温度变化引入的不确定度和u5（c）。

标准工作溶液是由标准储备液稀释得到，1 000μg/mL标准溶液稀释10倍得到100μg/mL标准储备液，100μg/mL标准储备液分别稀释5倍、10倍得到20μg/mL和10μg/mL标准溶液，10μg/mL标准溶液分别稀释2倍、10倍得到5μg/mL和1μg/mL标准溶液，20μg/mL標准溶液稀释10倍得到2μg/mL标准溶液。在稀释过程中分别使用到1mL单标移液管（A级）4次，2mL单标移液管（A级）1次，5mL单标线容量瓶（A级）1次，10mL单标容量瓶6次。

（1）量器校准引入的不确定度。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[10]1mL、2mL、5mL单标移液管及10mL单标容量瓶允许误差分别为±0.007mL、±0.010mL、±0.015mL、±0.02mL，按均匀分布，包含因子k=3，则相对标准不确定度分别为u4rel（1mL）=0.007÷（3×1）=4.04×10-3;u4rel（2mL）= 0.010÷（3×2）=2.887×10-3;u4rel（5mL）=0.015÷（3× 5）=1.732×10-3;u4rel（10mL）=0.020 ÷（3×10）= 1.155×10-3。

（2）温度变化引入的不确定度。校准过程中室温变化为（20±5）℃，水的膨胀系数为2.1×10-4mL/℃，按照均匀分布，k=3，则温度变化引起的不确定度为u5rel（1mL）=（1×5×2.1×10-4）÷（3×1）=6.062×10-4，同理u5rel（2mL）、u5rel（5mL）和u5rel（10mL）均为6.062×10-4。

Urel=urel×k                                                       （7）

则样品相对扩展不确定度Urel（山梨酸）=0.022 5×2=4.50%，Urel（糖精钠）=0.017 9×2=3.58%。本样品中山梨酸含量均值为0.169 5g/kg，糖精钠含量均值为0.138 0g/kg，因此扩展不确定度 U（山梨酸）=0.169 5g/kg×4.50%=0.007 6g/kg，U（糖精钠）=0.138 0g/kg×3.58%=0.004 9g/kg，故样品中山梨酸含量最终测定结果为X（山梨酸）= （0.169 5±0.007 6）g/kg（k=2），糖精钠含量最终测定结果为X（糖精钠）=（0.138 0±0.004 9）g/kg（k=2）。

4 结 论

根据国标方法测定酒类样品前处理方法较为简单，因为样品均匀程度高，无需沉淀蛋白，基本无不溶性固性物，所以样品前处理步骤不确定度主要来自样品的称量和样液的定容。通过不确定的评定过程可以得出，称量和样液的定容对整个试验的不确定度影响较小。本试验主要的不确定度来自标准工作曲线和仪器重复测定样品。其中，影响标准曲线不确定度的主要因素是标准曲线溶液的配制，标准物质不确定度对标准曲线溶液配制不确定度影响较大，实际操作过程中应选择准确度等级较高的标准品，严格把控标准物质的保存温度、保存环境，并对开封后保质期内的标准物质进行期间核查。同时注重仪器的维护保养，并定期进行仪器期间核查和仪器检定，保持仪器运行的良好状态，通过增加平行样测定次数，降低测量的不确定度，从而提高测定结果的准确性，减少测定结果的不确定度。

参考文献

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[8]国家标准物质研究中心.化学分析测量不确定度评定：JJF 1135—2005[S].北京：中国质检出版社，2014.

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[10]河南省计量科学研究院.常用玻璃量器检定规程：JJG 196—2006[S].