近红外光促脂质体释药及光热治疗

龚玲俐 刘 含 陆 爽 王慧敏 范於菟 陈永盛 杨昌英

(三峡大学 生物与制药学院， 湖北 宜昌 443002)

脂质体因其与细胞膜的相似性和显著的载药转运能力而引起广泛关注[1]．脂质体载药适用于水/油溶性药物，可提高药物生物利用度、溶解性，实现延长药物循环，降低药物毒性[2]．近年来，新型多功能脂质体的开发成为热点，如复合高分子[3]，表面修饰等[4]．金纳米簇(AuNCs)是一类直径2～10 nm左右的金粒子，通常由几十个金原子组成[5]．近年来，AuNCs因其具有合成方便、荧光性能突出、光学/胶体稳定性好、生物相容性好等优点而作为探针或药物运载工具[6-8]．AuNCs能够在高强度激光下长时间成像，其吸收和散射截面通常比有机染料大5～6个数量级[9]．同时，AuNCs具有光热转换能力，近红外激光照射下温度升高，可用于肿瘤的光热治疗(PTT)[10]．

本文以牛血清蛋白(BSA)为模板，37℃温和反应，制备得到AuNCs，透析至中性，作为水化介质，原位制备载药脂质体．磷脂选用卵磷脂(EPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG-2000)，药物选用香豆素6(C6)，形成AuNCs杂化载药脂质体Lips/C6@AuNCs，利用AuNCs的光热效应实现药物光控释放．进一步对脂质体表面进行修饰，如肿瘤靶向因子叶酸(FA)、谷胱甘肽(GSH)，缓释成分葡甘露聚糖(KGM)，达到靶向释药和长循环，提高脂质体药物的生物利用度．合成路线及作用原理如图1所示．

图1 Lips/C6@AuNCs制备路线示意图

1 试剂和仪器

蛋黄卵磷脂(EPC，纯度≥40%)、胆固醇(CH)和小牛血清蛋白(BSA，IV)购于Sigma公司，DSPE-mPEG-2000购于西安瑞禧，魔芋葡甘露聚糖(KGM)来自湖北一致魔芋公司；其它试剂均为国产分析纯．

吸收光谱和荧光光谱测试分别在UV-2600紫外分光光度计(日本岛津)和FL-4600荧光分光光度计(日本日立)上进行；粒径和Zeta电位使用ZS-90粒度电位仪(英国马尔文)测试；光热实验选用808 nm激光灯(长春镭锐)；AuNCs与Lips/C6@AuNCs形态用F200场发射高分辨透射电子显微镜(日本电子)观测；体系温度变化以便携式高精度温度计监测(美国，Omega)．

2 实验过程

2.1 AuNCs的制备

采用模板法制备AuNCs．称量0.375 g BSA溶解于5 mL PBS缓冲溶液(pH=7.4， 0.2 mM)，在4℃冰箱放置12 h后使用．向BSA溶液中缓慢加入0.5 mL HAuCl4溶液(0.1 M)，混合2 min后，加入0.7 mL 1.0 M的氢氧化钠，于37℃剧烈搅拌12 h．得到的溶液8 000 rpm/min离心除去不溶性杂质，在PBS介质中透析4 h以上(8 000～14 000 Da，美国)除去NaOH等小分子，得到AuNCs，呈中性．

2.2 Lips/C6的制备

采用薄膜水化-超声法制备装载C6的脂质体Lips/C6．以EPC∶DSPE-mPEG-2000∶CH∶C6=10∶2∶1∶1的质量比称取所需试剂共计21 mg，完全溶解于3 mL的氯仿溶液后旋转蒸发形成磷脂薄膜，45℃的真空干燥过夜除尽溶剂．加入5 mL PBS缓冲溶液，45℃温育30 min，涡旋混匀5 min后在0～4℃冰水浴间断超声15 min(功率400 W)，4 000 rpm/min离心除去游离的C6，得到Lips/C6．

2.3 Lips/C6@AuNCs的制备

磷脂薄膜的制备方法同上，以5 mL的AuNCs分散液代替PBS缓冲，温育磷脂薄膜，超声，离心，得到Lips/C6@AuNCs．

2.4 Lips/C6@AuNCs表面修饰

分别配置0.1 M谷胱甘肽(GSH)，0.023 M叶酸(FA)(以EDC活化过)，0.5wt% KGM水溶液．与上述Lips/C6@AuNCs体系以体积比1∶1混合避光磁力中速搅拌2 h，即可分别得到Lips/C6@AuNCs-KGM，Lips/C6@AuNCs-GSH，Lips/C6@AuNCs-FA体系．

2.5 Lips/C6@AuNCs形态观测

利用高分辨透射电镜观测AuNCs与Lips/C6@AuNCs的表观形态，体系溶液分散均匀，稀释10倍，将样品涂布于直径4 mm铜网上，自然风干，抽真空15 min除去表面悬浮杂质，进行观测．

2.6 光谱测试

光谱测试均使用1 cm四通石英比色皿，C6和AuNCs吸收光谱分别以甲醇和水为参比，扫描范围：200～800 nm. AuNCs的荧光发射光谱测试时，激发波长设置为380 nm，发射波长扫描范围：400～700 nm，狭缝5.0 nm，电压700 mV．除了探讨荧光强度与温度的关系实验外，光谱测试均在室温下进行．

2.7 C6包封率

配制质量浓度分别为1.0，2.0，4.0，8.0，16.0和32.0 μg/mL的C6甲醇溶液，利用紫外-可见分光光度计测定450 nm处的最大吸收值，作出C6的紫外吸收标准曲线．离心收集脂质体系中游离的C6，溶于甲醇，测定吸收值，根据公式(1)计算包载率EE：

(1)

其中：wf，wt分别指游离C6的质量和C6的总量．

2.8 光热效应

采用808 nm激光发射器作为光源(功率密度2.5 W/cm2)，分别垂直照射定量体积且呈液体状态的AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs、Lips/C6@AuNCs-KGM、Lips/C6@AuNCs-GSH、Lips/C6@AuNCs-FA体系10 min，记录体系的实时温度，连续读数，时间间隔为10 s，绘制温度变化曲线．

以照射10 min后自然冷却为一个光热效应测试循环，往复4个循环，根据温度变化曲线，测定各体系的光热效应稳定性．

2.9 药物溶出实验

为了探究Lips/C6@AuNCs体系是否具有光促进药物释放的特性，利用透析膜(截留分子量8 kD)模拟药物溶出，并设置近红外光促释放实验组，光源为波长808 nm激光(功率1 W/cm2)，pH 7.4 PBS缓冲溶液为释药介质，体系温度37℃，光照组局部温度略高，溶出总时长36 h，定时定点取样，处理样品，光谱测试，计算溶出度，绘制溶出曲线．AuNCs的光热转换能力使得脂质体双膜破裂，药物快速地释放，病变部位药物浓度急剧升高，可达到较好的治疗效果．另外，Lips/C6@AuNCs-KGM体系有对于脂质体膜表面的对抗血流剪切应力的保护作用，以及增强长循环作用，减少对药物运输中的泄露，将药物尽可能多的运输到病变部位，治疗效果更佳．Lips/C6@AuNCs-FA体系具有靶向肿瘤的功能，药物主动运输至肿瘤部位，减少对健康细胞的损害，提高药物生物利用度，增强抗癌效果．

2.10 体外细胞毒性及光热治疗

为了在体外检测Lips/C6@AuNCs体系的细胞毒性，选择人肝癌细胞HepG2细胞作为典型肿瘤细胞，定期进行相应的细胞抑制实验．采用3-[4，5-二甲基噻唑-2]-2，5-二苯基四氮咗溴盐(MTT)测定游离香豆素6、AuNCs的细胞毒性以及808 nm激光源处理的AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs体系的细胞毒性．将1×104个HepG2细胞铺在96孔板上孵化于DMEM标准培养基(美国Gibco)，含有10wt%胎牛血清(四季青)和1wt%青链霉素混合双抗(美国Solarbio)，在5%二氧化碳培养箱中37℃恒温培养24 h，然后分别加入游离香豆素6、AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs体系，细胞溶液中的浓度分别设置为0、12.5、25、50、100、200 nmol/mL，继续孵育48 h．再向每孔加入10 μL的MTT(5 mg/mL)，孵育4 h．最后，小心除去细胞培养液，并加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)溶解晶体，室温下轻柔振荡5 min，用酶标仪记录在490 nm下的吸收光谱．所有实验共进行5次，每个结果取平均值．808 nm光源处理的样品浓度为200 nmol/mL，功率为2.0 W/cm2，每孔照射时长为5 min．其他实验步骤与上述一致．

3 结果与讨论

本研究按照如图1所示路线合成组装得到Lips/C6@AuNCs体系，并进一步修饰脂质双膜，靶向运输至肿瘤部位，808 nm近红外光透皮释药，治愈病变部位．

3.1 Lips/C6@AuNCs形态

利用日本电子捷欧路JEM-F200高分辨透射电镜观测AuNCs的外观，如图2a，图中有数个黑色小颗粒，推测为几十个金原子图案簇在一起形成的颗粒，即为AuNCs，尺寸约2 nm，这与文献[1]中所报道的以牛血清蛋白为模板的尺寸一致．图2b为透射电镜拍摄Lips/C6@AuNCs的外观，可观察到颗粒内部存在一个黑色的球心内腔，其外部包裹一层不透明薄膜，尺寸约为120 nm左右．脂质体是磷脂分子亲水头部暴露于水相，疏水尾部聚集在一起避开水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡．根据透射电镜图像，进一步推测Lips/C6@AuNCs体系的组装方式，作为缓冲溶液的AuNCs包裹于脂质体中心水腔，疏水性的C6封装于脂质体疏水双分子层中，这与预想的组装方式一致．

根据2.5方法得到C6吸收标准曲线为A=0.163 6CC6+0.064 46(R2=0.999 2)．根据包封率计算公式分别得到Lips/C6包封率95.02%，Lips/C6@AuNCs包封率为61.22%，可见杂化体系仍保持较高的载药率．

图2 高分辨透射电镜下的AuNCs(a)和Lips/C6@AuNCs(b)

3.2 Lips/C6@AuNCs吸收、发射光谱

利用紫外-可见光谱仪和荧光光谱仪测定AuNCs和Lips/C6@AuNCs体系的吸收发射光谱．如图3a，AuNCs在560 nm处有一个宽吸收峰，在近红外一区950 nm处有小的吸收，理论上说明AuNCs具有光热效应；以波长380 nm激发，扫描得到荧光光谱，AuNCs发射强烈的红色荧光，最大发射波长为670 nm左右．如图2b，Lips/C6@AuNCs的吸收光谱由于C6的吸收使得体系在600 nm以下吸收值变大，但在近红外一区的吸收不变；同样的条件激发，Lips/C6@AuNCs显示两个发射峰，510 nm处是C6的发射峰，而此时AuNCs的吸收红移至800 nm，说明体系内发生了荧光共振能量转移，间接证明体系构建成功．

图3 AuNCs和Lips/C6@AuNCs体系紫外吸收、荧光发射光谱

3.3 Lips/C6@AuNCs粒径电位表征

利用粒径电位分析表征Lips/C6@AuNCs体系的表面修饰情况见表1．

表1 不同体系粒径与Zeta电位

Lips/C6@AuNCs粒径相比Lips/C6粒径变化不大，均为120 nm左右，说明封装AuNCs并不影响脂质体颗粒大小；Lip/C6与AuNCs的Zeta电位分别为-3.01 mV和-17.2 mV，两者组装之后的Zeta电位增大至-37.0 mV，ζ电位数值越大，反映体系越稳定，AuNCs杂化脂质体体系电位达到-30mV以上，稳定性一般；相比于电位±5 mV以下，易于凝结的Lips/C6体系，该体系稳定性增强．由于GSH和FA都是小分子化合物，Lips/C6@AuNCs-GSH和Lips/C6@AuNCs-FA体系粒径几乎不变，但Zeta电位变化明显．GSH是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，其巯基与Lips/C6@AuNCs体系AuNCs作用，端基酰胺键带正电，与测得Zeta电位为+19.7 mV结果一致．利用羧基活化试剂碳二亚胺盐酸盐将FA末端羧基活化，另一端带正电氨基与带负电的Lips/C6@AuNCs作用，而FA末端的羧基显负电，这与测试结果-32.3 mV电荷一致．KGM是糖基末端连接一个乙酰基团的中性多糖，具有促进免疫功能的功效，本身耐受性好，不容易被机体消化吸收，使Lips/C6@AuNCs-KGM体系实现延长药物循环和结肠定点释放的功能．它与脂质体之间有一定的弱相互作用，通过磁力搅拌使两者结合．测试结果显示体系粒径增大至(238.05±6.45) nm，Zeta电位降低至-26.2 mV．

3.4 Lips/C6@AuNC光热效应

利用近红外光源发射器和Omega便携式高精度温度计测定Lips/C6@AuNCs体系的光转化成热的能力．近红外光源波长为808 nm，激光功率为2.5 W/cm2，测试溶液体积规定为1 mL，照射时长均为600 s，测试结果如图4所示．图4a为Lips/C6、AuNCs和Lips/C6@AuNCs三者近红外光照射后的温度变化曲线，AuNCs的温度变化最明显，10 min由25℃上升到72.9℃；Lips/C6@AuNCs其次，温度上升至59.9℃；而同样的条件Lips/C6仅上升14.8℃．可见，AuNCs光热转化效率高，杂化到脂质体中，仍然可以保持较好的光热效应．光照射下，脂质体温度升高，流动性加大，有望实现药物加速释放．Lips/C6@AuNCs-KGM、Lips/C6@AuNCs-GSH、Lips/C6@AuNCs-FA的光热效应测试结果如图4b，揭示表面修饰并不影响体系的光热效应，所有体系均有良好的光热转化效率．

图4 808 nm照射下，(a)Lips/C6、AuNCs、Lips/C6@AuNCs温度变化图;(b)Lips/C6@AuNCs、Lips/C6@AuNCs-GSH、Lips/C6@AuNCs-FA、Lips/C6@AuNCs-KGM温度变化

实验发现，Lips/C6@AuNCs光热转化稳定性良好，如图5所示，体系光照升温，冷却后再光照，体系在同一时间周期，温度上升幅度不下降，4个循环后，体系Lips/C6@AuNCs仍保持良好的光热活性，说明光照升温不会破坏体系结构，可逆性和重复性好．

3.5 Lips/C6@AuNCs体系荧光强度与温度的关系

探究了温度对Lips/C6@AuNCs体系的影响，主要测定了其荧光发光的情况．将AuNCs和Lips/C6@AuNCs体系分别从15℃加热至60℃，以15℃的荧光强度为基础强度，计算其他不同温度下的相对荧光强度，作出以I/I0与温度的关系图(如图6所示)．图中Lips/C6@AuNCs的荧光强度随温度的升高而下降，并呈线性相关，这一特性可将AuNCs作为荧光探针应用于分析细胞内线粒体[11]温度，高温对于靶向肿瘤治疗具有深远意义，Lips/C6@AuNCs体系有实现精准温度可控肿瘤光热治疗的潜能；AuNCs荧光发光能力减弱同时发热性能增强，所以一定条件下，温度越高，Lips/C6@AuNCs体系光转化热的效率越高．

图6 Lips/C6@AuNCs体系荧光强度随温度变化图

3.6 体外药物释放实验

利用透析法模拟体外释放试验，设置近红外光照组和无光照组进行对照，透析袋内为待释放样品，近红外光直接照射样品，药物释放环境为pH 7.4 PBS缓冲溶液，每间隔一定时间取样一次，测定药物释放量，绘制累积释放药物百分比与时间的关系曲线(如图7所示)．图7(a)是Lips/C6@AuNCs体系的光促释放图，溶出36 h，无光照组累积药物释放率仅为49.93%，而近红外光照组达到85.42%，释放率明显高于无光照组，可见，AuNCs杂化体系光促释放效应明显．事实上，AuNCs本身的光热效应还可实施光热杀死肿瘤细胞，达到光促释药和光热治疗的协同效果．图7(b)是Lips/C6@AuNCs-KGM体系药物释放曲线，总体上看，由于KGM的修饰，药物释放变得缓慢，延长药物在体内循环时间，红外光照射下，体系释药有加快的趋势，但敏感性降低．图7(c)是Lips/C6@AuNCs-GSH体系药物释放曲线，GSH存在下，光照下体系36 h总释放率达到94.23%，略高于Lips/C6@AuNCs．GSH属于肿瘤因子，在肿瘤微环境中，浓度较高，可见Lips/C6@AuNCs进入肿瘤细胞，可以自主结合GSH，增加光促释药灵敏性，快速释药．FA是典型的肿瘤靶向因子，在Lips/C6@AuNCs表面修饰上FA，可以增强体系肿瘤靶向效应，从图7(d)看出，该体系在红外光照射下，药物释放增强非常明显，36 h可以达到89.68%的释放率．

红线：近红外光照组，黑线：无光照组图7 Lips/C6@AuNCs体系及各修饰体系的光热释药曲线

AuNCs的光热转换能力使得脂质体双膜破裂，药物快速地释放，病变部位药物浓度急剧升高，可达到较好的治疗效果．另外，Lips/C6@AuNCs-KGM体系有对于脂质体膜表面的对抗血流剪切应力的保护作用，延长药物停留时间，减少药物运输中的泄露，将药物尽可能多地运输到病变部位，治疗效果更佳．Lips/C6@AuNCs-FA体系具有靶向肿瘤的功能，药物主动运输至肿瘤部位，减少对健康细胞的损害，提高药物生物利用度，增强抗癌效果．

3.7 体外细胞毒性及光热治疗

以BSA为模板合成的AuNCs合成条件温和，生物相容好，具有较好的光热效应；C6具有一定的毒性可作为模拟药物，通过标准的噻唑兰(MTT)法检测不同浓度AuNCs、C6、Lips/C6@AuNCs体系处理48 h的HepG2细胞的细胞活性．0～200 nmol/mL浓度的AuNCs几乎不对HepG2细胞产生毒性，如图8(a)，证实了AuNCs应用于载药体系的良好的生物相容性；而香豆素6的细胞毒性很明显，200 nmol/mL浓度下HepG2细胞的存活率仅50%，200 nmol/mL也作为合适的浓度用于接下来的体外光热治疗实验．

AuNCs与Lips/C6@AuNCs均具有良好的光热效应，可应用于光热治疗．将808 nm激光作为光源，分别对浓度为200 nmol/mL的AuNCs、Lips/C6与Lips/C6@AuNCs激光照射(2.0 W/cm2，5 min)．下图8(b)结果显示，AuNCs具有一定的光热治疗效果，而Lips/C6没有光热效应则无光热治疗效果，Lips/C6@AuNCs联合光热与化学治疗，对HepG2细胞的细胞毒性达70%以上，治疗效果显著．

图8 (a)AuNCs、C6的HepG2细胞毒性；(b)AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs光热细胞毒性

4 结 论

本实验中，金纳米簇杂化脂质体体系Lips/C6@AuNCs药物封装率较高，稳定性好，光热效应效果明显，体系具有明显光促释药的特性，近红外光辐照下能够实现短时间内高效定点释药；且表面可进一步修饰肿瘤靶向因子等，实现靶向给药、延长药物循环时间等功能．体外光热与化学治疗肿瘤细胞效果显著，本研究为脂质体给药、肿瘤治疗等方面提供了新思路．