宠物犬牙菌斑的微生物菌群结构分析

韩 磊，周常喜，赵一帆，张艳萍，崔利鑫，吴实权，陈 武

(北京农学院 动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

牙周疾病是成年犬最常见口腔疾病之一，在所有犬种中患病率高达80%以上[1]。在英国，犬的牙周疾病已经与骨关节炎和超重/肥胖并列成为影响动物福利的三大重要疾病[2]。

细菌及其形成的牙菌斑是一切口腔疾病的始动因子[3]。由于卫生习惯或口腔清洁的难度大，在犬常会形成牙菌斑的大量蓄积，口腔微生物浓度增高，进而引发严重的口臭、齿龈炎、齿龈出血、龋齿、齿折与齿根脓肿等继发疾病。轻则影响食欲和采食量，重则进食困难甚至停止进食，继发营养不良和多种疾病乃至危及生命。分析牙菌斑的微生物菌群结构，对于防治各种口腔疾病，保障犬只健康有着十分重要的意义。近年来，人们对微生物组研究领域的革命性进展都是归功于高通量测序技术以及宏基因组学的发展。同在高通量测序技术出现之前的细菌培养的方法相比，许多培养条件苛刻的微生物在高通量测序技术的帮助下得以被检测到，而且高通量测序技术可以检测到许多的低丰度物种，因此使用不依赖培养法的细菌16S rRNA基因测序为快速确定犬牙菌斑样本的微生物群落结构和犬牙科疾病的诊断与防治药物的研发提供了可能。

1 材料与方法

1.1 材 料

样本来自于北京地区动物医院接受免疫接种的健康犬64只，品种不限，年龄分布在2到8岁之间。试验犬在采样前4周内没有接受过抗生素治疗，并且在牙齿上可以用眼观察到存在颜色深浅不同的牙菌斑。

采样前，先用无菌生理盐水对要进行样本采集的牙齿进行冲洗，将唾液以及食物残渣清除，然后使用无菌刀片在冲洗区域沿牙齿表面刮擦，使用3只无菌棉棒分别沾取刀片上的牙菌斑样本，将无菌棉棒连同牙菌斑样本一同分别置15 mL无菌离心管中，-80℃冰箱保存。随机抽取一只样本进行检测，其余2只作为备份。

1.2 方 法

1.2.1 样本总DNA提取，PCR扩增及测序 牙菌斑样本的DNA采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50)试剂盒严格按照使用说明提取，然后使用1%的琼脂糖凝胶电泳来对提取出来的DNA进行完整性、纯度、片段大小和浓度的检测。

16S rRNA的V3～V4可变区通用引物设计为：341F：CCTACGGGNBGCASCAG，805R：GACTACNVGGGTATCTAATCC。PCR体系扩增程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，共25个循环。

样品送至博淼生物科技有限公司在HiSeq2500/MiSeq测序平台对牙菌斑微生物的16SrRNA V3～V4区进行高通量测序。

1.2.2 数据分析 首先，用FASTQC软件对原始的下机数据进行质量检测，将Adaptor和低质量的碱基序列去除掉，对测序原始的下机数据和质控后的样品reads数及数据量进行统计，然后对得到的全部有效序列进行后续分析。依据GreenGenes数据库，利用Mothur软件进行计算，最终得到可用的不包含嵌合体的序列。

根据序列的相似性水平，在QIIME(V1.9.1)软件中以97%的序列相似性将序列分化为数个操作分类单元(Operation Taxonomic Unit，OTU)，在得到OTU分组情况后，通过对数据库中已有的reference taxonomy(RT)参考，将OTU进行分类注释。

将各样本的OTU在QIIME2软件上进行计算，从而得出稀释曲线和多样性指数，检验此次试验数据的有效性以及可用性。然后对各样本微生物群落结构组成进行分析，以在所有样本中均有分布并且相对丰度均值≥2% 的菌属[4]为标准，对微生物群落结构中的核心菌属进行定义。

2 结 果

2.1 牙菌斑样本的DNA序列分析

牙菌斑样本的DNA经过在Illumina HiSeq测序平台上的测序，本次试验一共获得1 567 731条优质序列，平均每个样本为24 495条，这些序列可以被分类为 14个门，159个属。通过QIIME2软件对测序的出的OTUs数据进行计算，绘制出各个样本的chao1指数，Shannon-Wiener指数，Simpson指数以及Observed-species稀疏曲线图，得出的所有曲线趋势全部趋于平坦，代表本次测序的深度和宽度均达到要求。

2.2 牙菌斑微生物结构

根据对数据库中的RT将本次试验测得的序列进行物种分类，再构建样本与物种分类单元序列丰度矩阵，使用QIME软件对每个样本和每个物种单元分类进行序列丰度计算，从64例健康犬牙菌斑样本中分类到 14个门。其中门水平的高丰度菌落(相对丰度>5%)有5个，占总序列数的96.93 %，分别为：变形菌门(Proteobacteria，37.24%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，28. 48%)、放线菌门(Actinobacteria，12. 26%)、螺旋体门(Spirochaetes ，9.58%)、梭杆菌门(Fusobacteria，9. 38%)。本次试验除了发现5个丰度较高门水平的菌落以外，还有 5个门水平的菌落在每个样本中均有分布但相对丰度较小，分别是厚壁菌门(Firmicutes)、绿菌门(Chlorobi)、TM7、SR1、互养菌门(Synergistetes)。由此可见，牙菌斑微生物群落在门水平的分布相对集中。

同时，犬牙菌斑微生物群落结构在属水平的分布也相对集中，根据对核心菌属的定义共得到6个核心菌属，占微生物总序列的 73.41% 。分别为：卟啉单胞菌属(Porphyromonas，19.96%)、放线菌属(Actinomyces，14.12%)、棒杆菌属(Corynebacterium，12.19%)、奈瑟菌属(Neisseria，13.24%)、梭杆菌属(Fusobacterium，9.17% )、密螺旋体属 (Treponema，4.73%)，见图 1。

注：图中横坐标代表每个样本，纵坐标为百分比，每个曲线色块代表一个菌属所占该样本的微生物群落属层面的相对含量，不同颜色的色块代表不同的菌属

3 讨 论

在本研究之前，牙菌斑 (plaque)这一名词最早被Williams于1989年所提出，并且国外宠物临床上的许多研究已经揭示犬牙周病的主要病因为牙菌斑的细菌微生物所导致的[5]。目前，宠物犬的饮食习惯为质地相对较软的商品粮和罐头等食物，这会导致食物残渣同牙齿之间的摩擦作用显著下降 ,使得黏性食物残渣中的蛋白在牙齿上大量附着，充足的蛋白为口腔中的常在细菌提供了营养以及附着点，经过长时间的聚合从而形成了牙菌斑。而且对宠物犬牙齿进行刷牙的护理经常被大多数的动物主人所忽视，造成牙菌斑在牙齿上的大量增厚蓄积，引发犬的各类牙周疾病。所以说，牙菌斑是一切口腔疾病的始动因子[6]。因此，对于牙菌斑的微生物群落结构的研究很有必要。

微生物组中的核心菌属是指所有或者绝大多数样本共有的微生物[7]，目前在国内的宠物临床中，类似对犬牙菌斑微生物群落的相关研究报道较少，部分现有的研究只对牙菌斑微生物群落中所含有的细菌菌属进行了报道[8]，而本研究通过对1 567 731条优质的可鉴定序列进行分析，确定了核心菌属群落在犬牙菌斑微生物群落结构中的分布。通过本次试验可以得出，同在门水平定义微生物的核心微生物组相比，在属水平来定义要显得更加合理。

在国外对牙菌斑微生物群落结构的研究中，Amy Sturgeon[9]等通过对六只狗的健康口腔样本进行检测，发现在健康口腔中最常见的菌属是卟啉单胞菌属(39.2%)，镰刀菌属(4.5%)，嗜二氧化碳噬细胞菌属(3.8%)，德克斯氏菌属(3.7%)，莫拉氏菌属(3.3%)和贝氏菌属(2.7%)。通本次试验的结果相对比，牙菌斑微生物群落结构中与健康口腔中微生物核心菌属差异较大，只有卟啉单孢菌属的相对丰度降低，这可能与卟啉单胞菌属与后期增长的密螺旋体属相结合，而形成了口腔微生物的“红色复合物”有关[10]。 Ian J. Davis[11]等从健康牙龈，牙龈炎和轻度牙周炎的223只狗中收集龈下菌斑样品发现，卟啉单胞菌是所有疾病阶段中最丰富的属，尤其是在健康牙龈样本中更为明显。

Changin等通过对人与犬的牙菌斑的主要菌属对比，发现犬类的主要属是放线菌属，卟啉单胞菌属和奈瑟氏球菌属[12]，Dent和Marsh对9种动物(猴子，狐猴，老虎， ，长颈鹿和4只美国可卡犬)的牙菌斑进行了研究，证明了所有动物共有一个基本菌斑微生物群落的假设，他们提出以放线菌属，棒杆菌属，梭菌属，奈瑟菌属为代表可能构成人和动物齿龈缘斑块的基本成分[13]。Takada和Hirasawa通过研究发现牙菌斑与犬牙周炎疾病关系密切，他们认为棒杆菌属在犬牙周炎中的作用可能与牙龈卟啉单胞菌在人牙周炎中的作用相同[14]。Patel和Vadalia通过对53只犬牙菌斑相关的口腔细菌菌群进行鉴定，他们从犬的口腔中分离出的菌属包括放线菌属，奈瑟菌，卟啉单胞菌属，密螺旋体属可能构成犬牙菌斑的基本成分[11]。Davis等在犬牙菌斑的大型横断面研究中，发现牙龈卟啉单胞菌是所有健康状态中最常见的细菌，在牙龈下菌斑中的相对丰度为7.4[15]%。在本研究中，对犬牙菌斑样本中核心菌属的研究同以上文献研究结果一致，表明不同地区犬的口腔牙菌分布基本相同。

犬牙齿所在的口腔环境复杂，随着温度，pH值以及饮食习惯的变化都会导致牙齿表面的微生物群落发生改变，虽然本研究对牙菌斑微生物群落结构中的核心菌属群落做出了探究，但是，如何针对菌属结构，采取有效减少口腔细菌数量的方法，从而保护牙齿健康，这些都有待今后去进一步探究。

综上所述，通过本次对64例健康犬牙菌斑微生物群落的高通量测序分析确定了6个核心菌属，为进一步研究犬牙菌斑和预防犬牙周疾病的药物研发及筛选提供了基础研究材料，并且为宠物临床上对于犬牙周疾病的治疗提供了参考。