失笑散治疗原发性痛经的网络药理学研究*

胡国静，隋新月，王 潇，刘 卉

（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院妇科，山东 济南 250014）

原发性痛经（primary dysmenorrhoea）也称为功能性痛经，系指生殖器官无明显器质性病变的痛经。表现为经期及其前后周期性小腹疼痛，且常伴有恶心、呕吐、腹泻等症状，严重时会影响正常生活。有研究证明其跟月经期子宫内膜释放前列腺素（PG）有关[1-3]，中草药可能通过抑制PG的合成发挥外周镇痛作用和抗炎作用[4]。

失笑散出自宋代《太平惠民和剂局方》，全方仅有五灵脂、蒲黄2味药且用量相等，而且炮制方式特殊，其中蒲黄炒香、五灵脂酒研，淘去砂土各等分为末[5]，是临床治疗血瘀作痛的常用方。《古今名医方论》“失笑”者，忍俊不住而发笑。此方虽仅有2味平常之药，却能有效缓解瘀血疼痛，效果之佳使人忍不住发出笑声，故称之为“失笑散”。由于中药复方治疗疾病通过多途径发挥作用，导致其作用机制不够明确。而网络药理学的整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点符合中医的基本特征，可以揭示中药的网络调控作用，为研究传统中药与现代药理搭建了良好的平台[6]。故本研究旨在通过网络药理学探寻失笑散治疗原发性痛经的作用靶点，初步探究相关生物过程及作用通路，说明其作用机制，以便为进一步的研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 失笑散有效化合物及作用靶点、相应基因的检索与筛选 通过TCMSP（中药系统药理学数据库与分析平台）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库检索蒲黄的活性成分，再根据生物利用度（OB≥30%）、类药性（DL≥0.18）、半衰期（HL≥4 h）进行筛选，找到治疗原发性痛经的有效成分。利用TCMSP数据库搜索蒲黄（Pollen Typhae）每个有效化合物对应的潜在靶点信息，并除去没有靶点及重合的部分。通过BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库检索五灵脂（Faeces Trogopterpri）的有效化合物及作用靶点，设置Score cutoff≥30和P≤0.05进行筛选。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）数据库中的UniProtKB搜索功能，将物种设定为“人”，将所得到的靶点进行名称转化，利于进一步与疾病靶点进行匹配。最后整理出失笑散的有效化合物及靶点数据库。

1.2 构建失笑散“药物—化合物—靶点”的可视化网络图 将整理好的失笑散有效成分及靶点数据库上传至Cytoscape 3.6.1软件，构建失笑散“药物—化合物—靶点”的可视化网络图，由此分析得出失笑散治疗原发性痛经的主要有效化合物。

1.3 疾病靶点的检索及其与药物靶点的匹配 以“primary dysmenorrhea”为关键词，运用Genecards数据库（https：//www.genecards.org）获取疾病的相关靶点与基因，将结果导入Excel表中去重备用。利用VENNY 图（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将失笑散有效成分对应的靶点与疾病靶点取交集，得到失笑散与原发性痛经的共同靶点，将共同靶点整理到Excel表中备用。

1.4 构建PPI网络 将疾病与药物的共同靶点上传至 STRING 数据库（https：//string-db.org/），将物种设置为“人”，以获取蛋白之间的相互作用关系，下载结果中的TSV格式文档，将相关数据导入Cytoscape 3.6.1软件绘制关键靶蛋白PPI网络，根据degree值找出关键靶点。

1.5 基因功能及作用通路分析 将疾病与药物的10个关键靶点上传至 David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），对关键基因进行GO富集及KEGG通路分析，将阈值设定为P<0.05，筛选排名靠前的生物过程和通路。

2 结果

2.1 五灵脂、蒲黄的有效化合物及相关靶点 通过TCMSP、BATMAN-TCM数据库，设定 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h的标准值，分别筛选出蒲黄及五灵脂的化学成分，除去无对应靶点者共筛选出12个有效化合物，其中蒲黄6个，五灵脂6个，见表1。再借助 TCMSP、Uniprot、BATMAN-TCM 数据库，经过去重和筛选共得到五灵脂、蒲黄的作用靶点293个，整理到Excel表中备用。

表1 失笑散中候选化合物相关信息

2.2 失笑散“药物—化合物—靶点”网络构建 将整理好的失笑散有效化合物及靶点数据库上传到Cytoscape3.6.1软件，构建失笑散“药物—化合物—靶点”的可视化网络图，见图1。其中黄色圆形代表蒲黄和五灵脂，粉红色六边形代表蒲黄的6种化合物（PH1～PH6 分别为 （2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one、花生四烯酸、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素），绿色六边形代表五灵脂的6种化合物（WLZ1～WLZ6分别为ponalactone A、尿素、尿酸、五灵脂酸、续断皂苷E1、三羟基异胆固醇酸），蓝色菱形代表靶点基因信息，其中degree值越大则节点越大，根据degree值排名前4的化合物为槲皮素、山奈酚、花生四烯酸、三羟基异胆固醇酸，说明这几个化合物是发挥作用的关键活性成分。

2.3 原发性痛经相关靶点的筛选及与失笑散靶点的匹配 运用Genecards数据库获取原发性痛经的相关靶点，去重后共得到205个，导入到Excel表里备用。利用VENNY图将失笑散有效成分的靶点与疾病靶点进行匹配，得到共有靶点43个，分别为PTGS1、ESR1、 PTGS2、 PGR、 CASP3、 PPARG、 NOS3、ALOX5、PLA2G4A、PTEN、ESR2、PPARD、XDH、ADRB2、OPRM1、BAX、TGFB1、TNF、CYP3A4、CYP1A1、GSTP1、GSTM1、VEGFA、FOS、CDKN1A、MMP2、MMP9、IL6、TP53、NFKBIA、ERBB2、CAV1、IL1B、CCL2、CXCL8、PPARA、CRP、IGFBP3、IGF2、WNT4、AVPR1A、GHRL、TRPV1，见图 2。

2.4 构建PPI网络 将疾病与药物的共同靶点上传至STRING数据库，获取TSV格式文件导入Cytoscape3.6.1绘制关键靶蛋白PPI网络图，见图3。此网络图共包括关键节点37个（已除去关联度低且于最核心靶蛋白无关的节点），degree越大，其节点越大，表明与其他蛋白的相互作用越强。失笑散治疗原发性痛经的靶标中degree值排名前10的为IL-6、TNF、PTGS2、TP53、VEGFA、CASP3、CXCL8、FOS、NOS3、IL-1B，其相关degree数值见表2，说明这10个蛋白可能是治疗原发性痛经的关键靶蛋白。

2.5 GO基因功能富集分析 将10个关键靶点上传至David数据库，GO富集主要涉及98个生物过程，8个细胞组成和8个分子功能。将生物过程、细胞组成、分子功能按P值大小进行排序，P值越小表明富集程度越高。GO富集分析的生物学过程排名前20的条目见表3。结果表明6个靶点参与了炎症应答，6个靶点参与了RNA聚合酶II启动子转录的正调控，4个靶点参与了NO生物合成过程的正调节，4个靶点参与了凋亡过程的正调节，3个靶点参与了IL-6产生的正调节，3个靶点参与了NF-κB向核内输入的正调节，3个靶点参与了细胞对缺氧的反应，3个靶点参与了肽基丝氨酸磷酸化的正调节等，由此可知失笑散可以通过调节多种生物学过程治疗原发性痛经。

图1 失笑散“药物—化合物—靶点”的可视化网络图

图2 失笑散与原发性痛经交集靶点基因WENNY图

表2 失笑散作用于原发性痛经的关键靶点

图3 关键靶蛋白PPI网络图

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路分析主要涉及50条通路，根据P值进行排序，其中排名前20的信号通路见表4，包括TNF、Toll样受体、癌症通路、NOD样受体、NF-κB、MAPK信号通路等，提示失笑散通过多通路多靶点来治疗原发性痛经，且各通路之间存在相互联系。

表3 GO富集功能分析结果

3 讨论

痛经分为原发性痛经和继发性痛经两种类型。继发性痛经一般有盆腔脏器的器质性病变，包括子宫内膜异位症和子宫腺肌病等，而原发性痛经则无上述表现。原发性痛经青少年期常见，多在初潮后6～12个月发病。据国内抽样调查显示，中国女性痛经发生率为33.1%，其中原发性者占53.2%，痛经严重影响工作者占13.53%[7]，可见原发性痛经带来的痛苦不容小觑，对其治疗方法的研究具有很好的临床价值。中医学中痛经又称经行腹痛，痛经一词最早见于汉代张仲景《金匮要略·妇人杂病脉证并治》“带下，经水不利，少腹满痛，经一月再见”[8]。痛经的病因病机分为虚实两种，实者不通则痛，虚者不荣则痛，历代医家多将其分为寒凝血瘀、气滞血瘀、气血虚弱、阳虚内寒、肝肾虚损等证型[3]。杨爱萍等[9]通过对大量文献分析发现，原发性痛经患者中属血瘀者最常见占83.2%。这为临床治疗原发性痛经提供了活血化瘀的治疗思路。

失笑散出自宋代《太平惠民和剂局方》“治妇女产后心腹痛欲死，百药不解，服此顿愈”。失笑散作为治疗血瘀作痛常用方，在治疗瘀血阻滞型冠心病、胃脘痛、病毒性肝炎、计划生育、不孕症、宫外孕、原发性痛经等方面具有良好疗效[7，10]，这也证实了中医异病同治的思想。《本草纲目》记载：蒲黄，手足厥阴血分药也，故能治血治痛。生则能行，熟则能止。与五灵脂同用能治一切心腹诸痛。现代药理学研究发现蒲黄的乙醇提取液有明显的镇痛作用[11]，五灵脂可以通过细胞毒、抗炎、活血化瘀等作用治疗软组织损伤、消化性溃疡、疼痛等，且五灵脂与其他中药配伍治疗原发性痛经效果好，标本兼治[12]。失笑散对改善子宫动脉血流，改善血瘀型原发性痛经症状有疗效明显[13]，而活血化瘀药物具有改善平滑肌痉挛、消炎镇痛、调节内分泌等作用[14]。可见失笑散可以通过活血化瘀、抗炎镇痛等途径以达到对原发性痛经的治疗目的。虽然目前对五灵脂、蒲黄的药理学作用已经有了基本了解，但对其治疗原发性痛经的作用通路等研究少见，故本文就此方面做了相应研究。

表4 KEGG通路富集分析结果

本次研究发现失笑散治疗原发性痛经的关键活性成分为槲皮素、山奈酚等。槲皮素是失笑散中对应靶点最多的成分，具有较强抗炎能力的长效抗炎物质[15]，而山奈酚可以通过下调IL-6表达，上调TNF表达作用于炎症反应[16]。这二者都能通过调节炎症反应起治疗作用。

失笑散主要通过 IL-6、TNF-α、PTGS2（前列腺素G/H合酶2）作用于原发性痛经。原发性痛经的病理生理学主要与PG水平升高有关[17-18]，且IL-6、TNF-α等炎性因子也可以通过诱导炎症反应引起子宫平滑肌缺血缺氧导致疼痛的产生。TNF-α是一种重要的细胞因子，在炎症反应、细胞免疫、肿瘤免疫、低氧及血脂异常等多种生理和病理过程中均发挥着十分关键的作用[19]。由此可知失笑散可通过上调TNF-α表达以及下调IL-6、PTGS2表达，调节炎症反应过程及抑制前列腺素合成，起到治疗原发性痛经的作用。

根据GO富集分析显示，失笑散治疗原发性痛经的主要作用机制为细胞对缺氧的反应、肽基丝氨酸磷酸化的正向调节、炎症反应、NF-κB向核内输入的正调节。Kannan Priya等[18]认为前列腺素水平异常导致频繁/节律紊乱的子宫收缩，进而导致缺血和缺氧，引发痛经。钟华青[17]认为IL-6、TNF-α等炎性因子也可引起子宫平滑肌缺血缺氧。禹龙香[20]认为通过促进蛋白质磷酸化可以加强钙离子结合，从而抑制子宫平滑肌收缩，缓解疼痛。周宇博等[21]通过研究发现核转录因子的表达与痛经密切相关。

KEGG通路富集分析主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路等。失笑散可以作用于肿瘤坏死因子信号通路，调控TNF-α表达，缓解炎症反应，减轻血管内皮损伤[22]，有利于原发性痛经的好转。同样又可以作用于NOD样受体信号通路，通过抑制pracspase-1和pro-IL-1β的激活过程、抑制NF-κB信号等途径来调节炎症反应[23]。而NOD1可作为TNF通路的一个增敏剂[24-25]，也就是说TNF、NOD样受体信号通路及NF-κB信号通路之间有一定联系，三者都与炎症反应有关。原发性痛经作为炎症反应过程，其发生发展与参与炎症反应过程的各种递质有关[22]。KEGG富集结果表明失笑散可以通过多通路对原发性痛经起到治疗作用，主要涉及TNF、NOD样受体、NF-κB等炎症相关的信号通路。

综上所述，失笑散治疗原发性痛经是通过多靶点多通路发挥作用的，通过对主要靶点IL-6、TNF、PTGS2的表达进行调节以及作用于细胞对缺氧的反应、肽基丝氨酸磷酸化的正向调节、炎症反应、NF-κB向核内输入的正调节等生物过程，最终作用于炎症相关通路（TNF、NOD 样受体、NF-κB 信号通路），从而抑制前列腺素的合成及相关的炎性反应，减少子宫异常收缩带来的缺血缺氧、缓解疼痛，达到对原发性痛经的治疗目的。本研究仍有很多不足，比如有些化合物的分子式、分子量未找到，但仍希望能为失笑散治疗原发性痛经提供基础的生物信息学支撑。