设施番茄表皮蜡质测定及脂肪醇合成基因的表达分析

封文佳，韩瑞瑞，李嘉丽，柴乖强

(榆林学院 生命科学学院，陕西 榆林 719000)

陕西省榆林市属于典型的干旱半干旱气候[1]，长期风蚀、水蚀导致地表土壤中有机质流失严重，土地生产力降低，形成荒漠化[2，3]；本地区年降雨稀少集中，植物的生长环境较为恶劣，从而导致整个生态系统具有脆弱性和不稳定性。但是，榆林市全年光照条件好，地理优势明显，是陕西乃至全国设施农业发展的优生区。近年来，榆林市大力发展设施农业，已形成突出区域特色的设施蔬菜种植区[4，5]，可以有效地缓解淡季供需矛盾，新鲜蔬菜的供给得到有效保障，为促进产业持续发展、增产增收和贫困地区脱贫攻坚做出了积极的贡献。然而，由于设施蔬菜的连茬及重茬种植，使得在设施番茄生产中，病虫害有逐年加重的趋势[6]。

植物表皮蜡质是植物表皮中能溶于有机溶剂而不溶于水的一层晶体结构。其主要成分由酸、烷烃、脂肪醇、酯类、醛等组成。表皮蜡质因能限制非气孔性水分散失、阻止真菌孢子的扩散，因此在植物抗旱和病虫害防治方面发挥着越来越重要的作用[7]。表皮蜡质层是植物病原菌与宿主最先接触的区域，因此表皮蜡质势必在病原菌活动中起到关键性作用，有研究表明，表皮蜡质可以影响病原菌分生孢子的萌发和孵化[8]。目前，国内外对番茄蜡质合成的机理研究已经取得了一定的进展，但是对设施栽培条件下，其表皮蜡质的成分和晶体还鲜有报道，因此本试验采用GC-MS技术和电镜扫描，对设施番茄果实着色后期的叶片和果实表皮蜡质成分、含量及晶体结构进行测定和分析，同时运用qPCR技术鉴定番茄中脂肪醇合成相关基因的表达，以期为番茄抗病虫育种及揭示设施番茄蜡质合成机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选取抗病、高产品种“长丰5号”，番茄种子从榆林市庄稼医院种子公司购置。选取饱满的番茄种子，播于花盆中，选用园艺通用的混合基质栽培，在榆林学院西区日光温室中进行培养，待幼苗长到高约15 cm的时候，将生长一致的番茄秧苗以每穴1株，转移到铺设有滴灌袋的膜下栽培，生长约2个月后，采集生长一致，且叶位相同的叶片和果实材料进行蜡质测定，每个样品重复5次。

图1 番茄材料的种植

1.2 实验方法

1.2.1 番茄叶片及果实表皮蜡质的提取

根据柴乖强[9]提取蜡质的方法提取番茄叶片及果实表皮蜡质并准备CG-MD检测。

1.2.2 GC-MS检测分析

气相色谱-质谱联用系统分析方法参考WangZH等[10]的方法并做了部分修改。分析条件为：载气为氦气，进样量1微升，进样口温度为300 ℃，分流比2.5∶1，检测器温度320 ℃。升温程序：50 ℃保持2 min，以20 ℃/min升温至250 ℃，并保持2min，再以2.0 ℃/min升温至320 ℃，保持15 min。化合物经GC-MS检测后，得到其离子峰，并借助质谱数据库检索以定性化合物的类型。

1.2.3 扫描电镜分析叶片及果实表皮蜡质晶体

在番茄果实成熟期，取番茄叶片或用镊子撕下番茄果实的表皮，用曲别针固定于白纸板上，50 ℃烘箱里烘干24 h。扫描前，用刀片小心割下5 mm×5 mm大小叶片样品，用双面胶粘贴在样品台上进行喷金镀膜处理，置于场发射电子扫描电镜(Hitac Hi S-4800)中观察蜡质晶体的结构形态。

1.2.4 番茄脂肪醇合成相关基因的鉴定与表达分析

在番茄的成熟期，分别取叶片、果皮及根部，用无菌水清洗干净并吸干水分，保存于液氮中。提取番茄这三个部位的RNA(方法参考天根RNA提取试剂盒)，在检测合格后，分成两管，一管进行反转录，其余送至北京诺禾致源公司进行二代测序分析，基因的表达聚类分析采用广州基迪奥生物科技有限公司开发的在线工具(https://www.omicshare.com/tools/)进行。

qRT-PCR反应采用CFX96 Real-time PCR detection Systems，按照SYBR®Premix Ex TaqTM(TliRNase H Plus)试剂盒(大连TaKaRa公司)操作说明进行。相对定量参照ΔΔCt法，表达差异值采用2-ΔΔCt进行计算，ΔΔCt=ΔCt目标基因-ΔCtactin。

1.3 数据处理

采用Excel 2016对数据进行分析，并使用SigmaPlot12.5进行作图。

2 结果与分析

2.1 设施番茄叶片和果实表皮蜡质含量分析

通过气相色谱-质谱联用仪检测了设施番茄叶片和果实表皮蜡质成分和含量，结果表明，番茄叶片总蜡质含量显著低于果实(P<0.05)(图2-A)，设施番茄叶片和果实表皮蜡质的成分相同，都含有脂肪酸、醛、直连烷烃、支链烷烃、脂肪醇和三萜类等6种化合物，其中直链烷烃含量在各种成分中占据主导地位，其含量在两类器官中为790-905 μg·dm-2，其次是支链烷烃和三萜类化合物，超长链脂肪醇含量在6类化合物中仅排第四，总含量不高(25-53 μg·dm-2)。此外，通过比较，果实中的脂肪醛、支链烷烃、脂肪醇和三萜的总量均显著高于叶片(P<0.05)(图2-B)。

图2 番茄叶片和果实蜡质含量分析

2.2 设施番茄叶片和果实表皮蜡质中超长链脂肪醇分析

研究表明，超长链脂肪醇合成相关基因能调控植物表皮蜡质片状晶体的生物合成，因此我们分析番茄叶片和果实中脂肪醇各个链长，结果表明：C32脂肪醇在所有碳链化合物中占有绝对优势，其次是C28醇；设施番茄叶片中脂肪醇的链长分布范围较小，仅从C24到C32，没有检测到C22醇和C34醇；而果实中脂肪醇的链长分布范围较大，从C22到C34，说明番茄果实中合成的脂肪醇对链长的偏好性更强，可能分别存在一些对C22和C34醇偏好的基因。

图3 番茄叶片和果实蜡质中超长链脂肪醇链长分析

2.3 设施番茄叶片和果实表皮蜡质晶体结构分析

采用扫描电镜分别对设施番茄叶片和果实表皮进行观察，结果表明，番茄叶片和果实表皮呈现出不同的蜡质晶体结构。番茄叶片正(图4-A，4-B)、反面(图4-C，4-D)均呈现出光滑、无蜡质晶体出现。而果实表皮的蜡质晶体呈现出较为整齐的片状结构(图4-E，4-F)。

图4 番茄叶片和果实表皮蜡质晶体在扫描电镜分析

2.4 番茄超长链脂肪醇合成基因的鉴定与表达分析

为了研究调控番茄中的片状蜡质晶体合成的分子机理，我们基于番茄的转录组数据，发现13个参与片状蜡质合成的差异基因，并且在番茄不同的组织中，存在特异表达的基因(图5)。为了确定转录组测序结果的可靠性，利用qPCR对果实和叶片中所有的基因进行了表达分析，结果表明，所有基因的表达主要表现为三种类型，分别为在果实中高表达、在叶片中高表达和在两种器官中均有表达。定量表达的结果与转录组结果相互吻合(图6)。

图5 番茄叶片、果实和根中鉴定超长链脂肪醇合成基因

图6 超长链脂肪醇合成基因在番茄果实和叶片中的表达分析

3 结论与讨论

有研究表明，植物表皮蜡质能够抵抗病虫害的入侵、抗病、限制非气孔性水分的散失等，在植物抗旱保水和抵御病虫害等过程中发挥着及其重要的作用[11-13]。植物表皮蜡质层也是植物病原菌与宿主首先接触的部分，因此表皮蜡质势必在病原菌活动中起到关键性作用，例如，表皮蜡质可以影响病原菌分生孢子的萌发和孵化[8]。表皮层蜡质不仅可以保护植物不受病原微生物的侵害，同时还能保护植物免受昆虫的侵扰。例如没有表皮层蜡质的植物相比那些有蜡质层的植物来说，更易遭受食草性昆虫的侵袭，主要的原因是害虫更容易附着在蜡质稀少的植物体表面[14]。设施温室条件下，由于湿度较大，经常会面临病虫害的发生，因此研究设施番茄表皮蜡质的合成机理对于设施植物的抗病育种具有重要的理论意义。

当前，关于植物表皮蜡质的成分和蜡质合成机制，已经有较多的研究。其中研究最为透彻的是模式植物拟南芥，其表皮蜡质的成分主要由一些C20—C34的超长链脂肪酸及其衍生物组成，主要包括脂肪酸、醛、烷烃、初级醇、次级醇、酮类、酯类及少量二醇类。本文利用GC-MS测定了设施番茄叶片和果皮表皮蜡质的成分和含量，结果表明，番茄叶片和果皮的蜡质成分相同，都含有脂肪酸、脂肪醛、直连烷烃、支链烷烃、脂肪醇和三萜类等6种化合物，结果与拟南芥中蜡质的主要成分相似。

植物表皮蜡质晶体结构在不同的物种间存在显著差异。前人通过光学显微镜、场发射扫描电子显微镜等可以清晰地看到植物表皮蜡质晶体形态与结构，它们存在着各种不同的性状，如颗粒状、杆状和具钩的小杆状等。Barthlott研究了13000多种植物表皮蜡质后，非常系统地对各种蜡质晶体结构进行了分类与命名。通过总结，他将蜡质的晶体表观形态描述为片状、管状、棒状等26类。Barthlott等还发现，蜡质表皮的晶体结构在植物生长发育过程并不是固定的或一成不变的，而会随着蜡质成分或含量的变化而产生变化[15]。此外，在小麦等植物中的研究表明，蜡质晶体结构与其组分紧密相关，当烷烃含量较高时，植物蜡质呈现出无晶体或光滑结构；脂肪醇含量占主导时，蜡质呈现片状结构；而当β-二酮和羟基-β-二酮占蜡质总量较大时，蜡质则呈现出管状或棒状结构[16，17]。本研究中，我们发现设施番茄的叶片和果皮表皮蜡质晶体结果存在较大差异，主要表现为番茄叶片正、反面均呈现出光滑、无蜡质晶体出现，而果实表皮蜡质晶体则呈现出较为整齐的片状结构，说明调控番茄叶片和果皮蜡质合成的基因不同，可能分别属于蜡质合成的不同调节通路中。

关于植物表皮片状蜡质晶体的合成研究也已经有报道，研究表明，超长链脂肪醇是植物表皮片状蜡质晶体的主要成分，控制其合成的酶为超长链脂肪酰基辅酶A还原酶(Fatty acyl-coenzyme A Reductase, FAR)[9]。目前已经分别从拟南芥[18]和小麦[19]中克隆了多个FAR基因，它们的生物学功能也已经被研究清楚。同样做为模式生物的番茄，其表皮片状蜡质晶体合成相关基因的研究还鲜见报道。因此，本研究以设施番茄为对象，通过高通量测序，鉴定出13个参与脂肪醇合成的基因，通过聚类和表达分析，发现这些基因主要分为三类，这三类基因分别在果皮、叶片和根中特异表达。本研究所鉴定出的这些特异基因是否也能真正参与调控蜡质的合成，还有待进一步研究。