沙棘籽蛋白肽对db/db小鼠降血糖活性及肾脏保护作用

舒丹阳,熊 犍,刘鹏展,崔 春

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一个全球公共卫生问题,患病人数一直在上升,预测到2045年,约有6.93亿糖尿病患者[1]。DM作为一种慢性代谢性疾病以各种方式影响身体健康,身体器官(如肾脏、心脏、眼睛、血管和神经)的损伤、功能障碍和衰竭。高血糖引起的血管并发症造成代谢紊乱、氧化应激增加、肾多醇形成、蛋白激酶活化和晚期糖基化终产物的积累和肾小球的损伤[2]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是指糖尿病发展过程中引起的肾脏功能紊乱,是一种微血管并发症,并最终导致终末期肾病。DN的典型症状是细胞外基质增加导致基底膜增厚,肾小球系膜和肾小管间质增大,肾小球滤过率降低,玻璃体病变和坏死,足细胞丢失,尿微量白蛋白增加。糖尿病肾病患者的死亡率比无肾病糖尿病患者高约30倍[3]。因此,DN的防治日益受到重视。

沙棘(HippohaerhamnoidesL.)是一种天然的药食同源性植物,含有的沙棘多糖、原花青素以及酚酸类物质均具有显著的降血糖的活性[4-5]。近年来,越来越多的文献报道了沙棘籽蛋白的降血糖活性。沙棘籽蛋白能够显著降低STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖,提高脂肪酸代谢、降血脂、增加肠道益生菌[6],改善糖尿病引起的细胞炎症因子的表达[7]。刘洪霞等[8]也验证了沙棘籽蛋白对于db/db瘦素缺陷型糖尿病小鼠同样具备显著的降血糖活性。但是蛋白质由于分子量较大,导致功能性较差,降低了其生物利用率。而酶解蛋白质一般可以收获分子量较小和功能性较好的活性多肽[9-12]。例如,袁晓晴等[13]发现了癞葡萄酶解多肽具有显著的降血糖活性,而癞葡萄蛋白没有这种生物活性。

目前已有文献报道沙棘籽蛋白的降血糖活性,沙棘籽蛋白肽(SSPE)的降血糖研究尚未见报道。因此,本研究使用酶解后的沙棘籽蛋白多肽灌胃db/db糖尿病小鼠,通过测定体重、血糖值、脏器指数、肌酐、尿酸、尿素氮和尿蛋白以及肾脏病理切片等指标来探究对糖尿病小鼠的降血糖效果和肾脏保护作用,以期为多肽类的糖尿病药物开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

12只雄性SPF级m/m正常小鼠(5周龄)和60只雄性SPF级db/db糖尿病模型小鼠(5周龄) 购于常州卡文斯实验动物有限公司,动物许可证编号:2018D046;沙棘籽蛋白肽 实验室自制;盐酸二甲双胍 0.25 g/片,广州白云山天心制药股份有限公司;胰酶 10000 U/g,诺维信(中国)生物技术有限公司;乙醚(分析纯) 广州芊荟化玻仪器有限公司;96%牛血清蛋白 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;4%多聚甲醛 广州市化学试剂厂;无水乙醇 广州芊荟化玻仪器有限公司。

ACCU-CHEK Active活力血糖仪 罗氏诊断产品(上海)有限公司;丙二醛、尿素氮、肌酐、尿酸酶联免疫分析(ELISA)试剂盒 上海江莱生物科技有限公司;RT-6500型酶标分析仪 上海沛欧分析仪器有限公司;eclipse-e100型光片显微镜 日本尼康公司;AL204型电子分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司;BJ-500A型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;GL-21M型高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;THZ-82型恒温振荡器常州国华电器有限公司;雷磁PHS-3EpH计 上海仪电科学仪器有限公司;152VM4H01C型超低温医用冰箱 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SCIENTZ-18N型冷冻干燥机 东莞布鲁斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘籽蛋白肽的制备 采用此前的沙棘籽蛋白制备工艺[15],取备用的冻干蛋白(蛋白含量80%±2%)采用胰酶进行酶解,加酶量0.35%,温度45 ℃酶解6 h,8000 r/min离心15 min取上清液,冻干得到回收率75.38%、水解度13.55%的沙棘籽蛋白肽。

1.2.2 实验小鼠的分组及灌胃处理 对小鼠进行耳号标记,共有6组小鼠,每组12只,进行灌胃实验,灌胃时间为8周,给与普通饲料,饮用水为无菌纯净水,每次灌胃量均为0.5 mL。

m/m小鼠为正常对照组(NC),每日灌胃等量生理盐水。db/db糖尿病模型小鼠在适应性饲养7 d后测了初始血糖,与正常m/m小鼠相比,均为糖尿病小鼠,符合实验要求。将db/db小鼠随机分为5组:空白对照组(BC),每日灌胃等量生理盐水;阳性药物对照组(PC),每日灌胃300 mg/kg盐酸二甲双胍悬浮液;沙棘籽蛋白肽治疗组(SSPE),分为低剂量组、中剂量组和高剂量组,分别灌胃50、150和250 mg/kg沙棘籽蛋白肽(该剂量依据此前沙棘籽蛋白降血糖实验剂量组所设定)[8]。

1.2.3 小鼠检测指标

1.2.3.1 小鼠精神状态的观察以及体重和血糖的测定 观察小鼠的生理状态,毛发和采食量饮水量和排泄情况,每周测定小鼠体重,选择小鼠适应性喂养7 d后的初始体重,以及灌胃第1、4、8周后的体重数据进行统计分析。小鼠尾静脉取血,用血糖仪和血糖试纸测定每周血糖值,选择小鼠初始随机血糖,以及灌胃第1、4、8周后禁食8 h的空腹血糖值进行数据分析。

1.2.3.2 相关脏器指数测定 实验进行8周后,所有动物用乙醚吸入法[14]麻醉,眼球取血放于2 mL离心管中,后脱颈处死实验鼠,30 min后于4 ℃,3000×g离心10 min,取上层血清。取其肾脏、肝脏、脾脏和心脏称重,后将脏器、血清液氮速冻储存在-80 ℃下供后续实验分析使用。脏器指数的计算公式如下:

1.2.3.3 肾功能相关指标的测定 治疗8周后,收集24 h尿液。以牛血清白蛋白(BSA)作为标准样品,采用Bradford法测定尿蛋白含量[15]。采用ELISA试剂盒测定血尿素氮、血清肌酐、血尿酸以及肾组织匀浆中丙二醛的含量。各个指标的测定方法严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.3.4 肾脏组织病理学检查 组织学分析:取m/m小鼠、db/db空白对照组和各治疗组小鼠的新鲜肾脏,用4%多聚甲醛溶液固定24 h流水冲洗10 h,乙醇梯度脱水处理,二甲苯对肾脏组织进行透明处理;组织石蜡包埋,切片(4 μm),切片肾组织脱蜡,用HE染色,制备成中性树胶封片后用光片显微镜进行全景扫描。

1.3 数据处理

表1 沙棘籽蛋白肽对脏器指数的影响Table 1 Effect of SSPE on organ indexes for each group of mice

2 结果与分析

2.1 实验小鼠生理状态的观察

NC组小鼠生理精神都处于活跃状态,采食量和饮水量正常,排泄量正常(此处数据在本文中未呈现)。BC组采食量和饮水量明显增多,排泄量大,到实验中后期出现便秘的情况。行动迟缓呆滞,毛发粗糙,甚至局部掉毛现象,垫料潮湿,须3 d更换一次垫料。PC和SSPE治疗组生理状态有所改善,毛发顺滑有光泽,垫料较为干燥,7 d更换一次垫料即可。

2.2 沙棘籽蛋白肽对小鼠体重的影响

由图1可知,NC组小鼠体重呈稳定增长趋势,db/db各组小鼠的初始体重无显著性差异。实验8周后,BC组小鼠体重显著低于PC和SSPE治疗组(P<0.05),SSPE和PC各组间无显差异。这一结果表明,SSPE可有效缓解糖尿病对小鼠造成的多饮多食多尿,体重增长缓慢的不良影响。本实验结果与刘洪霞[8]用沙棘籽蛋白处理的db/db小鼠体重变化趋势保持一致,但与Yuan等利用沙棘籽蛋白处理的STZ诱导的糖尿病小鼠的体重变化有所差别,其结果是沙棘籽蛋白处理后相较于模型组体重减轻,在一定程度上缓解了糖尿病引起的肥胖症状[7]。主要原因可能是实验原料和动物模型构建的差异。

图1 沙棘籽蛋白肽对小鼠体重的影响Fig.1 The effect of SSPE on the body weights of mice注:*表示与BC组相比有显著性差异,#表示与PC组相比有显著性差异,P<0.05；图2同。

2.3 沙棘籽蛋白对小鼠血糖的影响

由图2可知,NC组小鼠血糖值稳定在一个低水平状态,无显著性差异。db/db各组小鼠的初始随机血糖都处于较高水平。灌胃1周后PC组降糖效果显著(P<0.05),BC与SSPE组空腹血糖无显著性差异。实验进行4周BC组血糖持续上升,PC、SSPE各组血糖显著下降。干预8周,SSPE组的血糖值(低中高分别为:19.53、19.94、20.00 mmol/L)显著低于BC组血糖峰值(29.56 mmol/L)(P<0.05)。SSPE各剂量组与PC组无显著性差异。与刘洪霞[8]研究的沙棘籽蛋白降血糖效果相比,SSPE后期未出现SSP后期的血糖返升的情况,说明SSPE的降血糖效果可能优于沙棘籽蛋白。袁晓晴等[13]研究的癞葡萄蛋白无降血糖活性,但酶水解后可以显著降低糖尿病小鼠血糖。由此可以推测酶水解提高了SSPE的降血糖活性,因此酶解得到的SSPE的降血糖效果优于沙棘籽蛋白。

图2 沙棘籽蛋白肽对小鼠血糖的影响Fig.2 The effect of SSPE on the glucose values of mice

2.4 沙棘籽蛋白肽对脏器指数的影响

测定小鼠脏器指数有助于评估SSPE对糖尿病小鼠的降血糖活性[16]。由表1可知,NC组小鼠各脏器指标均显著低于BC组(P<0.05),表明糖尿病已经造成db/db小鼠不同程度的脏器病变。PC组和SSPE组的肾脏指数均显著低于BC组(P<0.05)。近年来,多肽对动物脏器的保护效果逐渐被发现。张明艳[17]发现油菜籽抗氧化活性肽具备显著的抗糖尿病肾脏纤维化的效果。肝脏和脾脏指数变化趋势与肾脏指数变化趋势相似,庞佳楠[18]研究的酪蛋白抗氧化肽对肝细胞具有显著的保护作用。

表2 沙棘籽蛋白肽对肾脏相关血清指标的影响Table 2 Effect of SSPE on the kidney related biomarkers

在心脏指数方面,BC与SSPE各组间无明显差异,表明SSPE对糖尿病小鼠心脏保护作用不明显。上述结果表明SSPE对糖尿病小鼠的肾、肝、脾具有保护作用。这是因为活性肽可以减少氧化应激和炎症因子,减少TGF-β1的生成,抑制MAPK和核转录因子相关信号通路,从而对脏器细胞起到保护作用,这与文献[19-20]报道的类似。

2.5 沙棘籽蛋白肽对肾功能相关指标的影响

图3 肾脏病理切片(400×)Fig.3 Histological examination of the renal tissues(H&E stained)(400×)注：细箭头所指区域为肾小囊，粗箭头箭头所指区域为基底膜。

肾脏丙二醛是脂质过氧化物,糖尿病患者体内自由基过多,氧化反应剧烈,丙二醛含量较高,是肾脏损伤的指标之一[21]。由表2可知,NC组各项指标都处于较低水平,显著低于BC组(P<0.05)。SSPE各个剂量组和PC的肾脏丙二醛含量与BC组无显著性差异,由此可以推测,SSPE抑制丙二醛的效果不显著,不同蛋白酶作用位点不同,故其水解产物的抗氧化性也有所差别[22-23]。肌酐、尿素氮、尿酸、尿蛋白需要经过肾脏代谢[24],当肾脏毛细血管受到损伤,肾小球滤过率下降,通透性增加,这些肾脏相关指标都会升高[25]。SSPE组的肌酐、尿素氮、尿酸、尿蛋白显著低于BC组(P<0.05),此外,SSPE组的血清肌酐、血清尿酸也显著低于PC组(P<0.05),由此推测是二甲双胍作为药物对肾脏造成了一定的负担[26]。田颖刚等[27]研究了丝羽乌骨鸡活性肽能够显著改善因顺铂引发的肾组织氧化损伤和肾小管坏死。研究表明胰岛β细胞分泌的连接肽作为辅助降血糖的活性肽可以逆转糖尿病肾病初期症状,显著改善肾小球滤过率[28]。由此可以推测,SSPE在具备显著的降血糖效果的同时可以显著改善肾小球滤过情况,对肾脏具有一定的保护作用。

2.6 沙棘籽蛋白肽对糖尿病小鼠肾脏病理形态的影响

由图3可知,使用HE进行的组织学分析,NC组正常小鼠血细胞分布均匀,肾小球、肾小囊正常无明显的病理改变;BC组血细胞分布凌乱,肾小囊挤压性萎缩,基底膜增厚,系膜区变宽,这些都是糖尿病肾病的典型病理症状[29]。SSPE治疗可明显改善上述病变症状得到改善,说明SSPE对肾脏起到了一定程度的保护作用,各剂量组间无显著性差异。肾脏病理切片结果与上文中的血清、肾脏和尿液参数结果一致。推测可能是SSPE显著的降血糖活性,减少ROS,从而降低了胶原蛋白变性导致的基底膜增厚和细胞间基质沉积[19]。

3 结论

沙棘籽蛋白肽可以显著降低糖尿病小鼠的血糖水平,缓解糖尿病引起的肾小球滤过率下降,通透性增加和减轻脂质过氧化,并且改善肾小球肥大,基底膜增厚,肾小囊萎缩等症状。因此,沙棘籽蛋白肽将来可用于糖尿病的辅助治疗。但本论文尚未对沙棘籽蛋白肽进行分离纯化,并且其对肾脏保护作用的具体机理也不清楚,这都需要在将来深入探究。