苜蓿雄性不育系杂交组合F1代材料的研究

尚继红，陈彩锦，吴 娟，曾燕霞，张晓娟，王晓春，金学平 薛 伟，高 婷，魏淑花，张 蓉

(1.宁夏农林科学院固原分院，宁夏 固原 756000； 2.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 756002； 3.宁夏农林科学院植物保护研究所，银川 756002)

自加拿大学者1958年发现苜蓿雄性不育系(male sterility)20 DRC以来[1]，苜蓿雄性不育系在制种和育种利用中得到了广泛而深入的研究。其中国外学者在开展了大量杂交试验研究之后，得到利用雄性不育系配制的杂交种比一般优良紫花苜蓿品种产草量要高18%～50%[2]，美国DAIRYLAND.SEED公司，先后利用苜蓿雄性不育系培育出了优质高产的Hybridforce-620 苜蓿杂交品种，取得了巨大的经济效益[3]。我国自1978年吴永敷从草原一号杂花苜蓿(Medicagovariacv.Caoyuan No.1)中选育出雄性不育系材料后[4]，有学者陆续对苜蓿雄性不育系材料在制种中影响产量的因素进行试验观察与分析，以及在花器官的发育与构造、组织培养、回交转育，雄性不育系株系发育特征及杂种的产量、农艺性状、光合特性、生理特性、同工酶变化及杂交组合基因差异表达、杂种优势等方面进行了一系列的研究[5-12]。本研究是在以上研究基础上，根据耐旱苜蓿品种选育目标，对已利用雄性不育系材料获得的30个杂交组合F1代材料的农艺性状、产量及品质，在宁夏南部山区半干旱区域开展大田耐旱筛选试验，并综合分析评价，筛选出强优势组合及亲本材料，为苜蓿育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苜蓿雄性不育系株系材料(将引进的3株苜蓿雄性不育系单株进行无性扦插繁殖，形成株系材料)与不同紫花苜蓿品种株系材料(选择不同品种中的优良单株进行无性扦插繁殖所得材料)杂交获得的30个组合。详见表1。

1.2 试验设计及管理措施

试验对已获得的杂交组合在2019年3月下旬进行穴盘育苗，并在5月初进行大田移栽，其中移栽株距50 cm，行距100 cm。育苗与移栽以组合为单位，顺序排列。试验地移栽前进行灌水1次，保证成活率。其余田间管理等同于大田生产。试验地位于宁夏固原市原州区头营镇徐河村宁夏农林科学院固原分院头营试验基地，该地区海拔1 550 m，东经 106°44′，北纬36°44′，2019年1—10月份月平均气温10.36 ℃，降水总量399.3 mm，降水集中在6月下旬—9月下旬，降水总天数77 d，1—10月份月平均相对湿度61.8%。土壤为黄绵土，耕作层(0～30 cm)土壤pH=8.6，有机质11.12 g·kg-1，全盐1.26 g·kg-1，有效磷11.37 mg·kg-1，有效氮53 mg·kg-1，有效钾239.20 mg·kg-1。前茬为玉米，秋机耕1次，春耙耱旋耕各1次，地势平坦，茬口一致，肥力均匀中等，可以灌溉，地力等同于大田生产。试验在6月下旬人工除草1次，7月下旬除草1次。

表1 30个杂交组合及其亲本材料

其中01、02、03代表引进的3株材料。

1.3 测定指标及方法

生长指标：株高、分枝数。测定方法：在初花期测定株高，每个组合选取10株，测定地表面到植株最高点的绝对高度(单位为cm)，求其平均值。在初花期测定分枝数，每个组合选取5株，测定1级分枝数，其中1级分枝数是根颈部位直接抽出地面的茎枝为1级分枝。

产量指标：鲜草产量、干草产量、鲜干比。鲜草产量在初花期刈割前任意选取单株3株进行测定，留茬高度5 cm，刈割后于田间立即称鲜草质量(kg·株-1)。随后将鲜草自然风干，称取干重，即为干草产量(kg·株-1)。鲜干比=鲜草产量/干草产量。品质指标：中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗蛋白(CP)、相对饲用价值(RFV)。每个组合随机选取单株3株，在初花期刈割并在105 ℃下杀青1 h，60 ℃下烘干至恒重，粉碎混合均匀，保留样品，测定以上指标。其中CP、NDF、ADF的具体测定方法依据任继周等编著的《草原生态化学》，CP采用半微量凯氏定氮法测定；NDF和ADF采用Van soest法测定[13,14]，RFV=DMI(%BW)×DDM(%DM)/1.29，DMI是粗饲料干物质采食量，DMI(%BW)=120/NDF(%DM),DDM是可消化的干物质，DDM(%DM)=88.9-0.779×ADF(%DM)[15]。

1.4 数据分析

所有数据处理采用Excel 2007软件，其余数据的方差分析、相关性及灰色关联度的综合评价都采用DPS 17.0版数据处理软件进行，其中方差分析采用SSR法，相关性分析采用Spearman秩相关性分析，灰色关联度分析采用等权关联度分析。

2 结果与分析

2.1 生长指标

株高、分枝数是重要的产量因子。由表2可知，苜蓿雄性不育系MS-GN各单株与各品种的单株株系材料杂交，获得杂交组合株高都比较高(在72.9 cm以上)，且株高在85 cm以上的杂交组合有13个，其中位于前5位的杂交组合是9×M、4×M、18×M、11×M、13×M，株高依次为89.9 cm、89.1 cm、88.3 cm、88.1 cm、88.0 cm，经方差分析，相互之间差异不显著，株高最低的组合是5×M，为76.3 cm。杂交组合总体分枝数较少，其中杂交组合16×M分枝数最多，为17.8个；第2位的杂交组合为25×M，为17.4个；第3位的杂交组合为26×M和29×M，为16.0个，三者之间差异不显著，分枝数最少的杂交组合为8×M，为9.8个，经方差分析显示，杂交组合分枝数最少的组合与位于前3位的分枝数相差分别为8个、7.6个、6.2个，且差异显著(p<0.05)。

2.2 产量指标

草产量是衡量苜蓿生产性能的主要指标。杂交组合鲜草单株产量变化范围在0.34～0.97 kg之间，极差R=0.63，且鲜草产量处于前7位的组合之间不存在显著差异，产量由高到低的组合依次是18×M、9×M、16×M、5×M、10×M、17×M、13×M，鲜草产量每株分别为0.97 kg、0.90 kg、0.87 kg、0.83 kg、0.78 kg、0.74 kg、0.70 kg，鲜草产量最低的组合是29×M，每株为0.34 kg。杂交组合单株干草产量变化范围为0.08～0.23 kg，极差R=0.15，且干草产量前9位的杂交组合不存在显著差异，单株干草产量从高到低的组合依次是9×M、18×M、10×M、16×M、11×M、5×M、13×M、15×M、20×M，干草产量分别为0.23 kg、0.21 kg、0.20 kg、 0.20 kg、0.18 kg、0.18 kg、0.18 kg、0.18 kg、0.17 kg，干草产量最低的杂交组合是28×M，每株0.08 kg，与产量处于前9位的杂交组合差异极显著(p<0.01)。

表2 杂交组合生长指标及其产量指标

鲜干比反映牧草的干物质积累程度和利用价值[16]。Berg等研究表明，苜蓿的鲜干比与品质呈正相关，鲜干比高蛋白质的含量就高，适口性就越好[17]。因此，提高植株鲜干比是提高苜蓿品质的重要途径。结果表明，鲜干比最高的杂交组合是28×M，为5.09，第2位的杂交组合是5×M，为4.72，第3位的品种是18×M，为4.69，鲜干比最低的品种是3×M，为3.30，其余品种鲜干比介于3.55～4.50之间(表2)。

2.3 生长指标及产量指标的相关性分析

通过对苜蓿30个杂交组合生长指标和产量指标的Spearman秩相关性分析，得出株高与单株鲜重、单株干重呈正显著相关性(p<0.05)，单株鲜重与单株干重呈极显著正相关性(p<0.05)，其余各指标之间也存在一定的相关性，但均表现不显著(表3)。

2.4 品质性状

由表4可知，中性洗涤纤维(NDF)杂交组合23×M最低(36.66%)，组合26×M次之(37.72%)，27×M组合位于倒数第3位(38.59%)，杂交组合10×M最高(53.57%)，其余组合介于39.73%～51.29%之间；酸性洗涤纤维(ADF)最低的组合是29×M(29.72%)，组合23×M次之(30.59%)，位于倒数第3位的是组合27×M(32.19%)，最高的组合是18×M(52.62%)，其余组合介于32.80%～44.23%之间；粗蛋白(CP)含量位于前3位的组合依次是29×M>2×M>3×M，分别为21.75%、19.42%、18.44%，最低的是组合24×M(14.21%)。RFV位于前3位的分别是23×M(179.83)、26×M(156.23)、27×M(153.85)，最低的是18×M(88.75)，其余组合介于100.78～147.96之间。

表3 杂交组合生长指标及产量指标Spearman秩相关性

2.5 品质性状的相关性分析

表5数据显示，通过对品质性状Spearman秩相关性进行分析，ADF与NDF呈极显著正相关(p<0.01)，NDF与RFV呈极显著负相关(p<0.01)，ADF与RFV呈极显著负相关(p<0.01)，其余各指标也存在一定的相关性，但差异均不显著。

2.6 杂交组合的综合评价

在牧草的评价体系中，利用单一指标进行方差分析评价，不能突显出牧草的综合性状、特点及综合表现[18,19]，笔者采用灰色关联度分析方法对F1代资源材料进行综合分析评价。在杂交组合F1代材料的综合性能研究中，以株高、分枝数、鲜草产量、干草产量、鲜干比、CP、NDF、ADF、RFV这9个指标为1个灰色理论系统，进行灰色关联度综合分析，计算各材料与理想材料的关联度，关联度越大，表示参试材料越接近理想材料，其综合性状表现越优，反之则越差[20,21]。本试验对组合F1代数据采用标准化处理，分辨系数为0.5，进行灰色关联度分析。其中与理想材料关联的材料及关联系数如下23×M(0.925 4)>27×M(0.895 6)>26×M(0.875 6)>25×M(0.859 7)>30×M(0.845 5)>29×M(0.844 4)>28×M(0.818 5)>21×M(0.813 6)>14×M(0.739 7)>2×M(0.728 9)>8×M(0.722 9)>3×M(0.721 3)>12×M(0.719 1)>4×M(0.708 9)24×M(0.708 7)>19×M(0.696 7)>13×M(0.694 6)>1×M(0.685 7)16×M(0.685)>22×M(0.681 3)>15×M(0.667 3)>11×M(0.656 2)>20×M(0.654 7)>6×M(0.646)>7×M(0.637 1)>5×M(0.625 4)>10×M(0.624 9)>17×M(0.611 4)>9×M(0.591 2)>18×M(0.549 8)，通过以上分析，30个杂交组合F1代材料综合性状表现位于前5位的是组合23×M、27×M、26×M、25×M、30×M。

表4 杂交组合品质指标

表5 杂交组合品质指标Spearman秩相关性

3 讨 论

株高是构成苜蓿产量的重要因子，是苜蓿产量性状的重要表征指标，也是苜蓿生产性能形成的基础[22,23]。王瑞峰等研究表明，苜蓿的株高与产量呈显著正相关，且在当年种植的苜蓿中，草原三号和康赛株高最高[24]。郑敏娜等研究表明，苜蓿株高第2年优于第1年，2年中株高稳定且较优的是WL 168 HQ、WL 298 HQ、骑士[25]。柴晓燕等发现国外苜蓿品种CAL-6902在株高等方面表现优异，可以作为品种选育的材料[26]。同时就株高与产量的关系，伏兵哲等[27]研究得出，干草产量与株高呈极显著正相关。以及利用灰色关联度进行分析，得出株高对苜蓿产量影响处于第2位。本研究中，株高表现优异的是组合9×M、4×M、18×M、11×M、13×M，同时通过相关分析，得出单株株高与鲜草、干草产量呈显著正相关，这与韩路等[28]的研究结果一致。 苜蓿分枝数是反映植株生长状况的重要指标[29]。在本研究中，分枝数表现最优的是组合16×M、25×M、26×M、29×M，并且分枝数与草产量存在一定的相关性，这与伏兵哲、陈艳等[27,30]的研究存在相似性。草产量是苜蓿育种中的首要目标[31]，也是衡量生产性能最直接的指标。在本研究中，鲜草单株产量表现最优的是组合18×M、9×M、16×M、5×M、10×M、17×M、13×M，干草是9×M、18×M、10×M、16×M、11×M、5×M、13×M、15×M、20×M。同时，在牧草育种评价中，个体植株的农艺性状被作为重要指标[32]。在本研究中，单株的株高与产量呈显著正相关。因此，在后续育种材料的利用中，可以优先根据株高来对材料进行表型筛选。

在苜蓿育种筛选中，品质评价符合高质量牧草发展的需求，也与奶业的发展相呼应[33]。张杰等研究表明，增加苜蓿叶片含量,提高植株鲜干比是提高苜蓿品质的重要途径[34]。因此在苜蓿育种利用中，通过计算鲜干比及表型筛选单株叶片密度较大的植株，初步筛选出品质优良的材料，以便后续进行进一步品质的测定。在本研究中，鲜干比位于前3位的是组合28×M、5×M、18×M，且鲜干比与其余农艺性状、产草量没有显著的相关性。粗蛋白指标是评价苜蓿营养价值的重要指标之一[35,36]。大量研究显示，苜蓿初花期至开花期的粗蛋白质含量一般为17%～20%，有些品种开花初期粗蛋白的含量达22%～28%[35]，苜蓿高蛋白对猪、家禽、牛、羊都具有重要的意义，在猪日粮中添加10%的苜蓿叶粉替代菜籽粕，能提高仔猪成活率及生长，也能改善胴体品质[37]，在蛋鸡饲喂中加3%～5%的苜蓿草粉，可提高产蛋率及改善蛋黄的色泽[38]，采用人工脱水方式生产的紫花苜蓿作为精饲料，在牛、羊日粮中比重可达100%[39]。因此，将高蛋白的苜蓿草粉加入动物配合饲料中，减少了精饲料的利用。降低了成本，且效益也很突出。这足以显示出苜蓿粗蛋白含量的重要性。在本研究中，粗蛋白含量表现突出的材料是29×M、2×M、3×M。同时，纤维含量及饲料相对饲用价值也是评价牧草品质的重要方面，其中中性洗涤纤维含量与苜蓿采食率呈反比，酸性洗涤纤维与家畜消化率成反比[40,41]，相对饲用价值越高，其营养价值越高，饲喂效果越好[42]。将中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维及相对饲用价值连同粗蛋白含量作为F1代材料品质鉴定的重要指标。结果显示，中性洗涤纤维是材料23×M最低，26×M次之，27×M位于倒数第3位，酸性洗涤纤维是材料29×M最低，23×M次之，位于倒数第3位的是27×M，RFV由高到低是23×M、26×M、27×M。且品质指标中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维呈极显著正相关，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维分别与RFV呈极显著负相关。

在苜蓿育种中，单一指标优良的材料可继续作为优异材料筛选或应用。但是在实际生产需求中，一个品种或品系是否优异不仅仅从产量来凸显，还需综合考虑品质、适口性等方面。为此，笔者采用灰色关联度分析法对材料的产量、农艺性状及品质进行综合评价。其优点是不需要大量的样本数量，也不要求数据有典型的概率分布[36]，同时灰色关联度分析是对一个发展变化的系统发展动态的量化比较,根据各因素各曲线间几何形状的相似程度来判断关联度，关联度越大说明因素间变化态势越接近，其相互关系越密切[43]。本研究所有材料综合评价表现最优的是组合23×M、27×M、26×M、25×M、30×M，但需进一步进行表型观测及鉴定筛选。

4 结 论

利用雄性不育系材料MS-GN-01、MS-GN-02、MS-GN-03与苜蓿品种优势单株杂交获得的F1代材料，经过初步鉴定筛选，获得性状、产量、品质优异材料如下：株高9×M>4×M>18×M>11×M>13×M，并且株高与鲜草、干草产量呈显著正相关；分枝数16×M>25×M>26×M>29×M，且分枝数与产草量存在一定的正相关，但差异不显著；鲜草产量18×M>9×M>16×M>5×M>10×M>17×M>13×M；干草产量9×M>18×M>10×M>16×M>11×M>5×M>13×M>15×M>20×M；鲜干比 28×M>5×M>18×M；粗蛋白29×M>2×M>3×M；中性洗涤纤维23×M<26×M<27×M；酸性洗涤纤维29×M<23×M<27×M；相对饲用价值由高到低是23×M>26×M>27×M，且所有材料的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维与相对饲用价值呈极显著的负相关；综合评价表现优异的是23×M>27×M>26×M>25×M>30×M。以上优异材料及其父本材料可以继续进行综合杂交利用。