二代种子园马尾松苗期耐旱型优良家系的筛选

汪 挺，谭健晖，李 鹏，唐生森，杨章旗,

(1.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541006；2.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530002；3.广西马尾松工程技术研究中心，广西 南宁 530002)

马尾松(PinusmassonianaLamb.)是我国南方最主要的针叶树种，其适应能力强，生长迅速，综合利用程度高，在广西作为用材与产脂树种广泛种植[1]。随着全球气候变暖和水资源紧缺加剧，植物面临干旱胁迫的几率大大增加，对抗旱材料的选育和抗旱机制的研究成为林木研究的热点[2-3]。广西属于亚热带季风气候，年降雨量充足，但其地形复杂，以山地为主，受季风和地形的共同影响，导致雨水分布不均，东部多而西部少，形成多发季节性干旱和半干旱区域灾害。干旱胁迫是影响马尾松产量和造林成活率的主要因素，严重制约马尾松用材林与产脂林的发展[4-5]，培育抗旱品种，是应对干旱胁迫的一种经济有效的措施[6]。目前，关于马尾松的抗旱性报道集中于基础理论研究，利用不同种源马尾松幼苗进行干旱胁迫筛选和抗旱适应性机理的探讨。韩文萍等[7]研究表明，干旱胁迫下不同种源马尾松间的生理指标变化趋势相似，但变化幅度有较明显差异；胡晓健[8]研究表明，不同种源马尾松抗旱性与生长性状和生理性状有关。这些研究大多集中于种源水平或个体，而涉及二代家系水平下研究较少，缺乏对二代家系水平下马尾松耐旱家系的批量筛选。此外，植物生长特性作为反映植物苗期耐旱适应性的最直观指标，随干旱水平的增加具有显著差异，且植物生长发育特性受形态特征和生理生化指标的调控，两者之间存在显著相关关系[9-10]。杜明凤等[11]研究表明，生长指标是研究马尾松抗旱性的首要指标，并且其与生理指标显著相关。李佩佩等[12]研究显示，植物抗旱性是可遗传的，苗期可以作为植物抗旱性鉴定的重要时期，生长与形态均比萌发期直观。林木抗旱性的表现形式是复杂的多指标性状，使用单一评价方法难以准确描述其抗旱能力，因此，越来越多的研究者采用隶属函数、因子分析、综合抗逆性D值和聚类分析等综合评价方法进行鉴定参试品种耐旱性[13-15]。

文中以马尾松二代种子园54个优良家系为研究对象，在防雨大棚内持续自然干旱胁迫和反复复水干旱胁迫，进行生长和形态特征的研究，测定干旱胁迫下各家系的生长指标，采用因子分析与隶属函数分析评价家系间的耐旱性。对综合耐旱度量D值进行聚类分析，将供试家系划分成不同耐旱等级，以期筛选适宜干旱和半干旱地区生长和应用的耐旱型优良家系，为后期进行大田抗旱试验提供理论基础，为推广和应用马尾松耐旱型优良家系提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在广西壮族自治区林业科学研究院苗圃防雨大棚内进行，该区域地理坐标为东经108°20′32″～108°21′10″，北纬22°50′22″～22°50′40″，海拔80m,属于亚热带季风气候，年平均气温21.6 ℃，年平均湿度为80%，雨季主要集中在5—9月份，旱季主要集中在10—4月份[5]。

1.2 试验材料

试验材料为54个马尾松家系(编号19-201～19-255)，种子采自于广西国有派阳山林场马尾松二代种子园。2019年2月，在广西壮族自治区林业科学研究院马尾松良种繁育苗圃进行播种，发芽后转移至无纺纤维布容器(直径5 cm，高8 cm)育苗，基质材料配比为V椰糠∶V黄心土∶V泥炭土=6∶3∶1。2019年9月，各家系选取生长一致的健康苗木30株进行试验,家系平均苗高为(24.33±4.39) cm，平均地径为(3.44±0.54) mm。

1.3 试验设计

采用随机区组试验设计，设置3个随机区组(重复3次)，每个随机区组54个家系，每个区组内各家系以10株为1行，按株距10 cm，行距20 cm，去掉容器后移栽至温室大棚里的试验地，实施干旱胁迫，外围设置保护行，胁迫前每天正常浇水缓苗。于2019年10月开始干旱胁迫试验，胁迫前给苗木浇透水，之后停止浇水，模拟自然干旱胁迫30 d，记录苗木的萎蔫度，测定苗高与地径，同时给苗木复水，每行800 mL，复水7 d后待植株恢复正常生长时，统计各家系苗木存活率[5]。继续实施干旱胁迫，如此重复3次，第3次胁迫复水后，待植株恢复正常生长时统计各家系苗木保存率。每块试验地规格为12 m(长)×1.2 m(宽)×0.2 m(高)，培养所采用的土壤为马尾松林下黄心土。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 存活率与保存率计算 各家系持续干旱胁迫的存活率与反复复水干旱胁迫的保存率计算公式如下：

(1)

式中：S为存活率；ni为第1次胁迫复水后第i个家系苗木的存活株数；Ni为第i个家系试验苗木总数。

(2)

式中：P为保存率；mi为第3次胁迫复水后第i个家系苗木的存活株数；Mi为第i个家系试验苗木总数。

1.4.2 萎蔫度计算 萎蔫度的评价与计算参照徐超等[16]方法。萎蔫级数：0级(健康)；Ⅰ级(少数针叶出现萎蔫)；Ⅱ级(半数针叶出现萎蔫)；Ⅲ级(半数以上针叶萎蔫)；Ⅳ级(整株萎蔫)。萎蔫度计算公式如下：

(3)

式中：W为萎蔫度；Φi为第i级萎蔫；Ni为第i级萎蔫株数；Φmax为最高级萎蔫；∑Ni为总株数。

1.4.3 因子分析计算 利用R软件mvstats包的factpc函数，对干旱胁迫下各生长指标进行因子分析，计算各主因子方差贡献率及得分值。

(4)

式中：f(xi)为第i个综合指标的隶属度函数值；Xi为第i个综合指标值；Xmin、Xmax为所有参试材料第i个综合指标的最小值、最大值。

(5)

1.4.4 聚类分析计算 利用R软件factoextra包的fviz_dend函数，以综合耐旱度量D值为指标，采用Euclidean-Complete法计算距离,进行系统聚类分析，将54个家系聚类为不同耐旱类型。

采用Excel 2016、R 3.6.3软件进行数据的统计与分析。

2 结果与分析

2.1 马尾松不同家系幼苗对干旱胁迫的生长响应

对54个马尾松家系进行持续干旱胁迫30 d，各生长指标对干旱胁迫响应变化如图1(a)所示。各家系苗高增长量变幅最大，分布区间为0.6～1.8 cm；地径增长量分布区间为0.01～0.38 mm；萎蔫度分布区间为34.48%～68.0%，主要分布在49.14%～59.17%；存活率分布区间为23.33%～96.67%，主要分布在53.33%～86.87%。各指标变异系数如图1(b)所示，干旱胁迫下各生长指标的变异系数均大于10%，其中地径增长量变异系数最大，达到96.02%，对干旱胁迫最敏感。

2.2 持续干旱胁迫下各生长指标的相关分析

对各生长指标进行相关性分析(表1)。结果表明：持续干旱胁迫下，地径增长量与存活率极显著正相关，与萎蔫度极显著负相关；萎蔫度与存活率极显著负相关；苗高增长量与地径增长量相关性不显著。各生长指标间存在不同程度的关联，说明耐旱是多指标互作的过程，根据单一指标进行评价不能准确反应家系耐旱性。

图1 干旱胁迫下各指标变化分布

表1 干旱胁迫下各指标相关系数

2.3 持续干旱胁迫下各家系耐旱因子分析

为了避免各生长指标间的相关性造成信息重叠，对持续干旱胁迫下各指标进行因子分析，根据累积方差贡献率大于85%的原则，选择前3个主因子作为数据分析的有效成分，其累积方差贡献率达到94.56%，其中载荷量的高低反映主因子与各指标的相关程度(表2)。第1主因子与存活率和萎蔫度相关性最大，因子载荷分别是0.93和-0.90，主要反映各家系干旱胁迫下的存活情况，可称为存活因子。第2主因子与地径增长量相关性最大，因子载荷为0.96，主要反映各家系干旱胁迫下的苗木地径变化，可称为地径因子。第3主因子与苗高增长量相关性最大，因子载荷为1.00，主要反映各家系干旱胁迫下苗高变化，可称为苗高因子。根据回归估计法计算因子得分，以各因子的方差贡献率占3个因子总方差贡献率的比重计算权重。

表2 因子载荷与方差贡献率

2.4 马尾松不同家系耐旱性的隶属函数分析

在因子分析的基础上，利用隶属函数法对54个马尾松家系耐旱性进行综合评价，计算各主因子的隶属值f(xi)和权重Wi，并计算代表各家系耐旱能力的综合耐旱度量D值，D值变幅为0.090～0.748，按其大小进行排名(表3)。结果表明：19-249和19-220家系耐旱性相对较高，D值分别为0.748和0.743；19-208和19-219家系耐旱性相对较低，D值分别为0.090和0.235。

表3 马尾松不同家系耐旱性综合评价

续表3

2.5 马尾松不同家系幼苗耐旱性等级划分

采用欧式距离-最长距离法对综合耐旱度量D值进行系统聚类分析(图2)。在欧式距离为0.3的位置，可将54个马尾松家系分为3大类耐旱等级：Ⅰ类为高度耐旱型，包括19-220、19-242和19-249等14份家系材料，D值平均值为0.644；Ⅱ类为耐旱型，包括19-201、19-224和19-252等29份家系材料，D值平均值为0.463；Ⅲ类为干旱敏感型，包括19-208、19-219和19-248等11份家系材料，D值平均值为0.275。

图2 马尾松不同家系耐旱性聚类分析

2.6 复水干旱胁迫下马尾松幼苗保存率的分布特征

根据3次复水干旱胁迫试验，将保存率作为家系耐旱性评价方法。结果表明：54个马尾松家系保存率差异较大，变异幅度为0～66.67%；19-236和19-242家系耐旱性较好，保存率分别为66.67%和63.33%；19-207和19-208家系耐旱性较差，保存率均为0(图3)。

图3 复水干旱胁迫保存率

2.7 马尾松幼苗保存率与生长特性的相关性分析

以持续干旱胁迫各生长指标为x轴，复水干旱胁迫保存率为y轴，进行线性回归分析(图4)。结果表明，苗高增长量与地径增长量对保存率拟合效果不佳，决定系数(R2)分别为0.025和0.102[图4(a 、 b)]；萎蔫度与保存率拟合效果较好，回归方程为y=-2.032x+1.376，其中R2=0.600，P<0.001[图4(c)] ；持续干旱胁迫存活率与复水干旱胁迫保存率拟合效果最好，回归方程为y=0.772x-0.237，其中R2=0.690，P<0.001[图4(d)]，回归模型具有统计学意义。

图4 保存率与生长指标回归分析

以综合耐旱度量D值为x轴，复水干旱胁迫保存率为y轴，进行线性回归分析(图5)。结果表明：

回归方程为y=0.946x-0.154，其中决定系数R2=0.562，P<0.001，回归拟合效果较好，且具有统计学意义，表明两个指标存在直线回归关系，短期持续干旱胁迫综合评价结果与长期复水干旱胁迫结果有较好一致性。

3 讨论与结论

近年来，对马尾松的耐旱性研究集中于生理响应和分子调控机制，对不同家系耐旱性能力的评价与筛选有待探索。植物的抗早性评价指标主要有形态特征、生长发育、生理生化、产量鉴定指标等，由于生长指标与这些生理生化指标之间存在强相互关系，因此在一定程度上可以用存活率、萎蔫度、苗高和地径等生长指标作为大规模家系的评价与鉴定[17-19]。利用苗木生长和形态性状进行大规模耐旱性筛选，是一种经济有效措施，对于马尾松耐旱性的遗传改良是非常必要的。

图5 保存率与D值回归分析

本研究中，随着干旱胁迫程度增强，马尾松不同家系苗木各生长指标表现不同程度变异，变异系数均大于10%，其中地径生长量变异系数达到96%，对干旱胁迫的反应极为敏感。表明植物生长指标作为马尾松耐旱胁迫的敏感型指标，其不同家系间生长情况的差异性可作为筛选马尾松耐旱性家系的重要基础数据。相关性分析表明，地径增长量与存活率极显著正相关，萎蔫度与存活率极显著负相关，说明在相同干旱胁迫下马尾松幼苗存活率较高的家系，其地径生长量的累积较大，通过自身根系的增加和植物养分的蓄积具有更强的抗旱性能。

通过因子分析和隶属函数加权计算的D值是一个无量纲的数，使各家系的特性差异具有可比性，被广泛用于植物抗逆性评价[20]，任毅等[15]通过D值鉴定了301份小麦品种的耐旱性，崔博文等[21]利用D值评价不同马尾松种源耐低磷性。本研究显示，综合评价最终获得14个高抗旱型家系:19-203、19-215、19-220、19-232、19-233、19-236、19-238、19-242、19-243、19-247、19-249、19-251、19-254、19-255，这些高度抗旱型家系可作为今后干旱和半干旱地区种植的首先种质，用于这些区域马尾松耐旱型优良家系的推广和使用，并通过对这些优良家系种质资源的收集，进行大量组配，培育适宜大范围种植和推广的优良基因型家系，从而实现目标性状有效聚合。对复水干旱胁迫保存率与D值进行线性回归分析，回归方程为y=0.946x-0.154(R2=0.562，P<0.001)，表明两个指标评价结果具有显著相关性，因此，通过持续干旱胁迫下生长指标可以综合评价家系耐旱性强弱。在一定范围内可通过持续自然干旱胁迫的试验结果代替反复复水干旱胁迫试验，进而在一定程度减少苗木的损失。本研究通过综合耐旱度量D值评价各家系耐旱性，利用系统聚类分析将54个家系耐旱性进行分等定级，筛选出3类不同耐旱型家系：高度耐旱型(14个家系)、耐旱型(29个家系)、干旱敏感型(11个家系)。在接下来的研究中，以高度耐旱型家系作为试验材料，对其耐旱适应性的生理生化反应，以及分子和基因调控机制方面，有待进一步研究。