热休克蛋白70在冠心病合并2型糖尿病患者中的表达水平及临床意义

张航，许华山，刘超，文冰，赵文增

(郑州大学第一附属医院 心血管外科，河南 郑州 450052)

热休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)作为应激蛋白在缺血等应激状态下能够快速高表达，并转运到细胞膜上，还可以从细胞内释放入血，通过Toll样受体等促进大量炎症细胞因子释放以及参与机体的免疫反应[1-5]，从而引起血管壁的炎症反应，促进动脉粥样硬化，在冠心病(coronary heart disease，CHD)的发生和发展过程中发挥了重要作用。HSP70作为分子伴侣，可以抵抗细胞的凋亡，对抗细胞的氧化以及调节细胞的免疫功能，从而提高细胞对应激的耐受性，可保护胰岛β细胞由于应激导致的损害，避免凋亡。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者持续高血糖，抗氧化酶活性的降低以及抗氧化素的减少等导致HSP70的持续过度表达，从而影响HSP70的抗氧化能力[6-7]。高敏C-反应蛋白(high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)是一种急性期蛋白，在全身炎症和非特异性炎症过程中发挥重要作用，其表达水平与冠状动脉粥样硬化的严重程度高度相关，是CHD发生、发展和预后的独立危险因素[8-9]。此外，研究发现hs-CRP与胰岛素抵抗有密切关联。目前，HSP70与CHD或T2DM具有相关性已逐渐被认可[2,7,10-11]，然而多数研究只关注HSP70与CHD或T2DM的关系。本研究通过检测CHD组、T2DM组、CHD合并T2DM组及健康对照组4组研究对象的外周血HSP70表达水平，并以hs-CRP表达水平作为对照，探讨HSP70与CHD合并T2DM的关系以及HSP70水平与冠脉病变程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月至2019年12月于郑州大学第一附属医院拟诊CHD并住院行冠状动脉造影(coronary angiography，CAG)检查的患者300例，根据症状和CAG结果将患者分为4组，其中CHD组80例，T2DM组70例，CHD合并T2DM组90例以及对照组(非CHD非T2DM组)60例。所有研究对象及家属均同意参与本研究，并知晓其相关试验目的、研究过程和临床意义。本研究开展获得郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准。纳入标准：所有相关研究患者入院后均经过全面的体格检查，行相关影像学检查(胸片、心电图和多普勒超声心动图)以及完善血常规、血凝试验、肝肾功能、电解质等实验室常规检查，排除合并有恶性肿瘤、心脏瓣膜病、心肌病以及急慢性感染性疾病患者，患有严重肝肾功能不全以及心肺功能衰竭患者亦排除在外。T2DM诊断标准：依照中华医学会糖尿病分会2010年制定的《中国2型糖尿病防治指南》进行诊断，排除继发性糖尿病和1型糖尿病。CHD诊断标准：参照世界卫生组织1979年制定的冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准，以左冠状动脉主干、前降支、回旋支以及右冠状动脉中至少有1支血管狭窄程度≥50%判断为有意义病变，同时并根据累及血管病变支数定义为单支病变、双支病变和多支病变。CHD形态学分型：根据美国心脏病学会联合美国心脏协会1988年制定标准分为A、B1、B2和C型病变。

1.2 Gensini积分标准依据美国心脏协会制定的冠状动脉血管图像分段评价标准以及Gensini积分系统对每支病变血管狭窄程度的进行定量分析。1分：狭窄<25%；2分：≥25%，<50%；4分：≥50%，<75%；8分：≥90%，<99%；32分：≥99%。然后按冠状动脉每个分支狭窄的得分分别乘以相应系数，左主干病变：得分×5；左前降支病变：近段得分×2.5，中段得分×1.5，远段得分×1；对角支病变：第一对角支得分×1；第二对角支得分×0.5；左回旋支病变：近段得分×2.5，远段得分×1；RCA病变：近、中、远段得分×1；后降支得分×1；后侧支得分×0.5。由两位熟悉心脏病专业医生分别独立进行相关得分以及系数的判定，最后计算出来的得分总和的平均数即为该患者的Gensini积分。

1.3 标本采集及检测在行CAG前空腹采集所有相关研究对象肘正中静脉血5 mL，在离心机上以3 000 r·min-1离心15 min，然后取其上清液分装保存于-80 ℃超低温冰箱待测。HSP70及hs-CRP水平采用酶联免疫吸附法中的双抗体夹心法进行检测。相关检测试剂盒购自于武汉中美科技有限公司，试验步骤严格按照其操作说明书进行操作。使用美国Bio-Rad公司生产的Mode1550型酶标仪进行全自动定量分析。

2 结果

2.1 一般临床资料比较4组研究对象性别、饮酒、吸烟、年龄、收缩压、肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶、白细胞(white blood cell，WBC)计数、甘油三酯(triglycerides，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组研究对象体质量指数、空腹血糖及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较，CHD组、T2DM组、CHD合并T2DM组体质量指数均高于对照组，HDL-C低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；T2DM组、CHD合并T2DM组空腹血糖高于CHD组和对照组(P<0.05)；T2DM组、CHD合并T2DM组间空腹血糖比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CHD组、T2DM组、CHD合并T2DM组间体质量指数、HDL-C两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组研究对象一般临床资料比较

2.2 4组研究对象HSP70水平及hs-CRP水平比较单因素方差分析显示，4组研究对象之间HSP70水平及hs-CRP水平差异有统计学意义(P<0.05)。采用SNK法进一步进行两两比较，与对照组比较，CHD组、T2DM组及CHD合并T2DM组HSP70水平及hs-CRP水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与CHD组和T2DM组分别比较，CHD合并T2DM组HSP70水平及hs-CRP水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。经析因设计方差分析显示，CHD和T2DM在HSP70及hs-CRP升高方面有交互作用(F1=21.790，P1<0.001；F2=62.047，P2<0.001)。见表2。

表2 4组研究对象HSP70水平及hs-CRP水平比较

2.3 CHD组和CHD合并T2DM组HSP70水平与Gensini积分的关系与CHD组相比，CHD合并T2DM组冠脉Gensini积分更高，差异有统计学意义(P<0.05)；HSP70水平与Gensini积分在CHD组及CHD合并T2DM组均呈正相关，并且在CHD合并T2DM组相关性更好。见表3。

表3 CHD组和CHD合并T2DM组患者HSP70水平与 Gensini积分的关系

2.4 CHD合并T2DM组患者不同冠状动脉病变支数HSP70水平与hs-CRP水平根据冠状动脉病变支数将CHD合并T2DM组进一步分成单支病变组、双支病变组和多支病变组3组，单因素方差分析显示，3组间HSP70水平及hs-CRP水平差异有统计学意义(P<0.05)，采用SNK法进一步进行两两比较，与单支病变组比较，多支病变组、双支病变组HSP70水平及hs-CRP水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与双支病变组比较，多支病变组HSP70水平及hs-CRP水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 CHD合并T2DM组患者不同冠状动脉病变支数HSP70 水平与hs-CRP水平比较

2.5 CHD合并T2DM组患者不同冠状动脉病变类型HSP70水平与hs-CRP水平将CHD合并T2DM组患者依据冠状动脉病变类型进一步分为A型组、B1型组、B2型组和C型组，单因素方差分析显示，4组间HSP70水平及hs-CRP水平差异有统计学意义(P<0.05)，采用SNK法进一步进行两两比较，C型组HSP70水平及hs-CRP水平均高于A型组、B1型组及B2型组，差异有统计学意义(P<0.05)，而A型组、B1型组及B2型组3组之间HSP70水平及hs-CRP水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 CHD合并T2DM组患者不同冠状动脉病变类型HSP70 水平与hs-CRP水平比较

2.6 CHD合并T2DM组患者HSP70水平与hs-CRP水平相关性分析对CHD合并T2DM组患者HSP70水平与hs-CRP水平进行Pearson相关分析，结果表明二者呈正相关(r=0.728，P<0.001)。

2.7 CHD合并T2DM的危险因素分析首先将CHD合并T2DM作为因变量，然后将一般临床资料、hs-CRP和HSP70作为自变量先进行单因素logistic回归分析(将对照组赋值为0，CHD合并T2DM组赋值为1)，最后将有意义的变量吸烟、年龄、体质量指数、WBC计数、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C和hs-CRP或HSP70一并纳入多因素logistic回归分析模型，结果显示hs-CRP及HSP70水平升高是CHD合并T2DM的独立危险因素。见表6、7。

表6 CHD合并T2DM单因素分析

表7 CHD合并T2DM多因素logistic回归分析

3 讨论

CHD发病机制是由多种危险因素共同作用的，尤其炎症和免疫反应在CHD的发生和发展过程中起着决定性作用。HSP70优先表达于循环系统，目前已经发现在人类的冠状动脉内皮组织和动脉粥样斑块内过度表达。对于HSP70在动脉粥样硬化发病机制的研究目前意见不统一，有研究认为细胞内HSP70作为保护性蛋白可以抵抗动脉粥样硬化[12-13]。然而，另外一部分研究认为细胞外HSP70与细胞内HSP70的作用可能有所不同，大量基础及临床研究显示细胞外HSP70加重炎症反应并促进动脉粥样硬化。细胞外HSP70可通过Toll样受体等介导激活核因子-κB，从而诱导免疫反应和促进多种炎症介质，比如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等炎症因子的释放，并通过增强基质金属蛋白酶-9表达和分泌，增强单核细胞穿透内皮细胞基质的能力[14-15]。本研究证实，CHD患者以及CHD合并T2DM患者中血清hs-CRP及HSP70水平均较对照组高。hs-CRP目前作为反映体内炎症反应的一种客观指标，能准确反映冠状动脉粥样硬化斑块内炎症反应状态，提示HSP70可能也参与了CHD的炎症发生和发展过程。T2DM发病机制和胰岛素抵抗密切相关，也有研究认为它是一种慢性低度炎症反应疾病。本研究结果显示T2DM患者和T2DM合并CHD患者外周血hs-CRP及HSP70水平均高于对照组，hs-CRP与胰岛素抵抗密切关联，重要的是胰岛素抵抗被作为是高血糖和动脉粥样硬化共同发病的生化代谢和基因遗传机制之一，提示HSP70对T2DM的发病过程具有重要作用，这和Nakhjavani等[7]研究结果相一致，他们的研究证实了T2DM患者WBC计数、CRP和HSP70等指标高于正常对照组。研究人员推测HSP70可能通过参与机体的免疫应答以及炎症反应机制促进了胰岛素抵抗的发生发展。Yabunaka等[16]研究发现，与对照组相比较，T2DM患者体内单核细胞中的HSP70水平明显升高，而T2DM患者HSP70水平与年龄却呈负相关。此外，Oglesbee等[17]研究酮症酸中毒患者，发现在平稳期时HSP70-2与血糖呈正相关。

本研究表明，HSP70在单独CHD或T2DM患者中均发挥了重要作用，尤其在CHD合并T2DM患者血清HSP70水平更高。经析因设计方差分析结果显示，CHD和T2DM在HSP70升高方面有交互作用。目前认为，T2DM是心血管系统疾病的一个非常重要的独立危险因素，持续长时间的高血糖刺激可以诱发心血管病变，促进冠状动脉粥样硬化的发展进而导致CHD。本研究对CHD合并T2DM患者外周血中HSP70水平与Gensini积分、hs-CRP水平进行Pearson相关分析，结果表明均呈正相关，而hs-CRP高表达明显促进冠状动脉粥样硬化已经广泛得到临床证实，说明HSP70的高表达与冠状动脉粥样硬化的严重程度呈正相关。本研究在CHD合并T2DM患者Gensini积分较CHD患者Gensini积分高，说明可能是糖代谢异常导致HSP70水平升高进一步加重血管炎症反应所致。Pirillo等[18]研究发现氧化型低密度脂蛋白可以诱导产生HSP70，而HSP70可以提高细胞对氧化型低密度脂蛋白诱导的凋亡的敏感性，并没有保护细胞对抗氧化型低密度脂蛋白诱发的细胞毒性作用。Svensson等[19]研究认为HSP70可能是氧化型低密度脂蛋白导致巨噬细胞中脂质沉积与启动炎症反应之间的一个环节。在临床工作中，合并有T2DM的CHD患者往往发病早，进展快，冠状动脉粥样硬化病变重。本研究进一步发现，在CHD合并T2DM患者中病变多支数组与双支数组、单支数组比较，HSP70表达水平明显升高，而且C型冠状动脉病变类型患者HSP70表达水平明显高于A型、B1型和B2型；logistic回归分析显示，hs-CRP及HSP70水平升高是CHD合并T2DM发病的独立危险因素。Zhang等[11]研究证实，与正常对照组相比，HSP70表达水平在急性冠脉综合征组以及稳定型心绞痛组均明显升高，并且在急性冠脉综合征组最高，HSP70表达水平与急性冠脉综合征的病情危险严重程度呈高度正相关性。高表达水平HSP70和低表达水平HSP70抗体是急性冠脉综合征患者发病的独立危险因素。然而，Zhu等[20]却持相反观点，他们认为高表达水平HSP70可以减少冠状动脉粥样硬化中膜厚度，从而降低CHD的危险性。

综上所述，本研究表明CHD和T2DM在HSP70升高方面有交互作用；HSP70水平与冠状动脉粥样硬化程度呈正相关；与单纯CHD患者相比，CHD合并T2DM患者HSP70水平更高，冠脉粥样硬化程度更重。本研究对CHD合并T2DM患者外周血中HSP70进行了初步探索，其相关作用机制依旧不清楚，尚需后续试验进一步明确。