茶树花青素生物合成研究中“组学”及相关生物技术的应用分析

李慧丽

摘 要：茶是一种重要的全球性经济作物，由其芽叶制作而成的饮品是“世界三大饮料之一”，其含有多种有益于人体健康的次生代谢物，如儿茶素、茶氨酸、有机酸等。紫叶茶树品种的发现，具抗氧化功效的花青素成为茶叶天然活性成分，使茶叶的保健功效更上一层。花青素作为植物中最大的一类水溶性天然色素，在果蔬、花卉中大量存在，其代谢途径已被深入研究。由于茶叶高花青素品种近年来才陆续被发现，所以对茶树中花青素的生物合成途径研究仍相对滞后。近年来，越来越多的研究运用“组学”技术配合其他生物技术来分离鉴定茶树中调控花青素合成的结构基因以及转录因子，虽有所获，但要完全揭示茶树中花青素代谢的分子机制还需深入研究。该文介绍了茶树花青素的测定技术，阐述了“组学”及相关生物技术在茶树花青素生物合成中的研究应用进展，以期为今后的深入研究提供参考。

关键词：茶树花青素;生物合成;生物技术

中图分类号 S571 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）20-0026-03

The Application of Omics and Related Biotechnology in Anthocyanin Biosynthesis

LI Huili

（Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract：Tea is an important global economic crop.The beverage made from its buds and leaves is“one of the three major beverages in the world”.It contains many beneficial secondary metabolites， such as catechin， theanine and organic acid.The discovery of purple tea leaves makes the anthocyanin， which has antioxidant effect，become the natural active ingredient of tea leaves，and further enhances the health care effect of tea leaves.As the largest water-soluble natural pigment in plants，anthocyanin is abundant in fruits，vegetables and flowers，and its metabolic pathway

has been deeply studied.As the varieties with high anthocyanin content in tea leaves have been discovered in recent years，the research on the biosynthetic pathway of anthocyanin in tea trees is still relatively backward.In recent years，more and more studies have applied “omics” technology and other biological technologies to isolate and identify structural genes and transcription factors that regulate anthocyanin synthesis in tea plants.Although some gains have been made，further studies are needed to fully reveal the molecular mechanism of anthocyanin metabolism in tea plants.In order to provide reference for further research，the determination technology of anthocyanin in tea was introduced， and the research and application progress of “omics” and related biotechnology in the biosynthesis of anthocyanin in tea was described in this papaer.

Key words：Anthocyanin of tea tree;Biosynthesis;Biotechnology

1 茶樹花青素测定技术

测定茶树中花青素及其组分，是探究茶树花青素代谢的基础，花青素含量作为可量化的性状指标，往往比叶色更加直观、准确，用于作为代谢途径中结构基因及转录因子差异表达的反映指标是科学且具体的。针对花青素总量的测定，对比Sun，B.[1]等年与李健[2]方法，他们选择的材料均为茶树品种“紫鹃”（前者源于华南农业大学茶园，后者源于福建省农科院茶研所），前者采用单次浸提、放置过夜的方法，后者则采用短时、多次浸提的方法;且两者提取缓冲液的选择与花青素总量吸光度的计算方法均不同，前者仅测定A353（花青素）与A650（叶绿素），而后者测定量为A350（花青素）、A620（可溶性糖）、A650（叶绿素），后者更好地排除了可溶性糖的影响，查阅资料发现，大部分研究选择的是后者Zheng and Tian[3]文献中的测定方法。

针对花青素组分的测定，对比Sun，B.[1]等与Kang Wei[4]等方法，所选材料仍均为“紫鹃”（后者源于杭州的TRICAAS实验茶园），前者采用高效液相色谱法（HPLC）分析出样品中主要含有此2种花色苷（cyanidin-3-O-galactoside与delphinidin-3-O-galactoside），后者则采用高效液相色谱联合质谱分析（LC-MS）分析，并增加矢车菊色素-3-O-半乳糖苷作为内参，分离出4种主要花青素（除上述2种，增加delphinidin-3-O-b-D-（6-（E）-p-coumaroyl）galactopyranosidecyanidin-3-O-b-D-（6-（E）-p-coumaroyl）galactopyranoside）。可发现得益于高效液相色谱与质谱技术的愈加成熟和更多标准样的分离及合成，花青素组分的鉴定更加全面。

2 cDNA提取及转录本获得与注释

当下探究花青素代谢途径分子机制的主流方式是提取茶树cDNA并进行转录组测序。近年来，除测序技术更新换代，茶树“舒茶早”全基因组测序的完成，也为茶树转录组测序以及进行SSR标记等提供了更精准的参考。对比Sun，B.[1]等、He，X.[5]等以及Wei Kang[4]等提取cDNA以及转录组测序的方法，其不同点主要在于试剂盒、测序公司的选择，测序深度以及对比数据库的不同上，得出的结论也随之呈现倾向性，但得益于茶树中类黄酮途径越来越多的结构基因序列被测定，如Lai，Y.S.[6]等所发表文献中展示的紫茶品种“紫嫣”类黄酮合成途径中高质量的CHS，CHI，F3H，FLS，F3′H，F3′5′H，DFR，ANS，LAR and ANR等基因的全长序列，使得对转录本所获差异基因进行qRT-PCR验证结果更准确。

3 系统进化树的构建与应用

根据差异表达基因系统进化树同源性分析锁定目的基因。对比Sun，B.[1]等、Kang Wei[4]等与He，X.[5]等的研究，其均采用ClustalX执行多个序列比对，通过邻接法利用分子进化遗传学分析软件MEGA构建进化树，其唯一不同是使用的MEGA版本分别为7.0、6.0、5.0。自MEGA软件问世，26年里共更新8个版本，最新版为MEGA X，其更新主要在于功能的增删和计算方式的优化，如MEGA4的2大新特征——采用图形图例格式以提供自然语言描述的模型和方法以便在分析中使用，以及提出Maximum Composite Likelihood（MCL）方法（用于同时评估所有序列对之间的进化距离;同时考虑或不考虑位点之间的速率变化和谱系之间的替代模式异质性;在不知情的情况下估计转移/转位偏倚和核苷酸替代模式）[7];而MEGA 5则优化了MCL方法，选择最适合的替代模型（核苷酸或氨基酸），推断祖先状态和序列（以及概率），以及每个位点估计进化率，且在计算效率、准确性、替代参数和站点间的速率变化方面得到提升[8];MEGA 7则推出了64位版本，能分析更大的数据集;MEGA X则支持多计算平台，能够在Windows和Linux操作系统上跨平台使用，并能使用多个计算核心进行多分子进化分析[9]。根据构建进化树的需求不同，不同领域对版本的选用也具倾向性，例如在微生物分析中最常用的是MEGA2.0。

4 亚细胞定位

亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，其意义在于为预测蛋白质功能提供有用线索以及推测蛋白质行使功能的模式，因为蛋白质只有处于特定的细胞环境才能正常发挥作用。对比Sun，B.[1]等与Kang Wei[4]等方法，发现两者虽均使用“GFP融合蛋白表达法”对目的转录因子进行亚细胞定位，但后者在方法上有所精进，除使用GFP荧光蛋白外，还增加了水稻金属转运体Nrat1和锌指转录因子ART1与红色荧光蛋白（RFP）融合作为参考定位标记（Nrat1定位于细胞膜，ART1表达于细胞核），这比仅用GFP荧光蛋白载体浸染作空白对照，更加清晰。查阅近年来关于茶树花青素生物合成的文獻，发现大部分都未使用亚细胞定位技术来作相应研究，即使使用也是如上文提到的两者，仅作的是目的蛋白在细胞中表达位置的浅显研究。目前蛋白质亚细胞定位的预测方法早已发展到对多信息融合利用进行蛋白质结构和功能注解的程度，相较于简单定位，其融合氨基酸的进化保守信息及位置特异性得分矩阵信息，以及蛋白质共有序列信息与基因本体论信息，来选取蛋白质特征信息并进行GO注释，同时结合氨基酸的物化性质，对蛋白质结构进行分割重组、功能进行对比推测。

5 结构基因与转录因子的互作研究

在对显著差异表达的蛋白进行分离、定位后，为对其功能及调控机制进行更深入研究，往往会根据前人研究寻找其作用绑定位点，再对差异表达的结构基因进行序列分析，看其是否包含有差异表达蛋白作用的位点元素，来初步确定此结构基因与差异表达蛋白的互作。常用的方法有酵母单杂交试验[1]、农杆菌渗透（GUS测定）法[4]等。其原理都是分离结构基因的启动子与差异表达蛋白的基因，并将它们搭载到含有报告基因的载体上，检查报告基因的表达来验证其是否相互作用。后者由于最终是转到模式植物中进行表达，应作空白对照，排除模式植物内源基因的影响;而前者目前通用的系统有GAL4系统与LexA系统，其中由于LexA系统中的BD（结合功能域）来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可减少假阳性的出现。

关于转录因子间相互作用的研究，目前较为常用的方法是酵母双杂交试验，并采用双分子荧光互补（BiFC）法进行验证。前者可用于判断转录因子负责相互作用的结构域，且所有操作均是在核酸水平上进行，无需纯化大量蛋白，可精确地测定蛋白之间的“弱”相互作用;后者用于辅助试验，可观察到转录因子互作发生的位置、强弱（荧光信号强弱来判断）、所形成蛋白质复合体的稳定性等，若进行实时观测，还可观察到蛋白质互作发生的时间。

6 目的基因的功能鉴定

由于茶树高多酚含量致使茶树遗传转化体系建立过程中存在转化效率低和离体再生困难的问题，现虽有多种改良技术，可优化茶树遗传体系的建立，但距离可直接在茶树中鉴定、表达功能基因，仍需作大量工作。目前，对于目的基因的功能鉴定主要采用的方法是烟草瞬时转化、拟南芥的稳定转化以及基因沉默等。比较Sun，B.[1]等与He，X。[5]等所用的烟草瞬时转化法，前者是将融合到35S启动子上的目的基因插入到根癌农杆菌进行瞬时测定，并分离成功表达的菌株克隆到相应载体上，用无针头针管浸染烟草叶片;后者的方法更为精进，其对重组菌株的选择采用菌落PCR鉴定法（鉴定出一个含有各靶标结构的单菌落），并用叶盘法对烟草进行转化，可更好地排除外源基因的干扰，减少假阳性情况的发生。除以上两种方法外，茶树基因沉默法也可用于功能基因的鉴定，如通过转录后沉默咖啡因合酶mRNA获得低咖啡因茶，但其要求已对功能基因的结构、作用机制充分挖掘。

7 结语

当前，“组学”技术已广泛应用于茶树花青素代谢途径研究中，但相较于其他经济作物仍滞后，处于摸索、模仿阶段。研究中采用的生物技术手段也较落后，停留在该技术使用的初级阶段，如对亚细胞定位技术的使用，仅停留在定位阶段，而对其衍生出来的蛋白功能注释未充分利用。对于花青素总量及组分的测定技术已十分成熟，对茶树花青素代谢途径差异表达基因的注释、分离得益于“舒茶早”全基因组序列的测定也较为精准，更多的问题在于基因或蛋白的功能鉴定，由于茶树遗传体系建立尚未完善，功能鉴定仅能从模式植物中获得“可能”结论，对分离鉴定出的基因能实际助力于产业发展还有很长的路要走。

参考文献

[1]Sun，B.et al.Purple foliage coloration in tea（Camellia sinensis L.）arises from activation of the R2R3-MYB transcription factor CsAN1.Scientific Reports 6（2016）.

[2]李健.‘紫娟茶树紫叶花青素积累机理的转录组分析[D].福州：福建农林大学，2016.

[3]Zheng X，Tian S.Effect of oxalic on control of postharvest browning of litchi fruit[J].Food chemistry，2006，96（4）：519-523.

[4]Wei Kang，Wang liyuan，Zhang Yazhen，et al A coupled role for CsMYB75 and CsGSTF1 in anthocyanin hyperaccumulation in purple tea[J].The Plant Journal，2019，97（5）：825-840.

[5]He，X.，Zhao，X.，Gao，L.et ai.Isolation and characterization of key genes that promote ?avonoid accumulation in purple-leaf tea（Camellia sinensis L.）.Sci.Rep， 2018， 8：130.

[6]Lai，Y.S.，Li，S.，Tang，Q.，Li，H.X.，Chen，S.X.，Li，P.W.，Xu，J.Y.，Xu，Y.and Guo，X.（2016）The dark-purple tea cultivar ‘Ziyan accumulates a large amount of delphinidin-related anthocyanins.J.Agric.Food Chem.2016，64，2719–2726.

[7]T Koichiro，D Joel，N  Masatoshi，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）Software Version 4.0[J].Molecular Biology & Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[8]Koichiro，Tamura，Daniel，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods.[J].Molecular Biology & Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[9]Sudhir K ，Glen S ，Michael L ，et al.MEGA X：Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms[J].Molecular Biology & Evolution，2018（6）：6. （責编：张宏民）