大豆多肽酸奶酶解工艺的研究

2020-11-16 02:06杨雨刘国涛靳前龙
农业与技术 2020年20期

杨雨 刘国涛 靳前龙

摘 要:利用三酶复合法将大豆蛋白水解,然后进行乳酸发酵,研制成新型大豆多肽酸奶。通过酶解条件的研究,确定中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶三者的最佳酶解条件,再将3种酶复合,采用正交实验的方法,其最佳酶解工艺最终得出结论为:中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的比例为1∶2∶4,反应温度55℃,反应时间4h,反应pH为6.5。同时确定最佳发酵条件:温度38℃,反应接种量4%,发酵时间5h,嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种比为1∶1。确定最佳的产品配方:蔗糖6%,乳粉4%,稳定剂0.9%。

关键词:大豆多肽;酶解工艺;复合蛋白酶;发酵

中图分类号:S-3       文献标识码:A

DOI:10.19754/j.nyyjs.20201030015

1 材料与方法

总体工艺流程[1]:挑选大豆→浸泡→脱皮→磨浆→热处理→过滤除渣→加蛋白酶→水解→酶灭活(80℃,15min)→均质→调配→接种乳酸菌→发酵。

1.1 主要材料

大豆:安阳市农业科学院提供,颗粒饱满,无虫蛀和霉变。

蛋白酶:木瓜蛋白酶(80万U·g-1)、中性蛋白酶(10万U·g-1)、菠萝蛋白酶(50万U·g-1)。

全脂乳粉:市售。

蔗糖:市售,干燥洁净,颗粒晶体状。

稳定剂:食品级,奶味饮料稳定剂。

菌种:嗜热链球菌(Streptococcus thermopHillus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)。

1.2 主要試剂

20%甲醛溶液(预先中和)分析纯,标准0.05mol·L-1NaOH溶液,0.25%的NaHCO3液体,0.05mol·L-1柠檬酸,其它化学试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

精密pH计(酸度计),意大利哈纳;JM 85A型胶体磨,山东省莱州市顺通胶体磨厂;DM-2100AⅢ自分渣磨浆机,河北沧州铁狮磨浆机械有限公司;HH—6电热恒温水浴锅,河南智诚科技发展公司;YB881—4电热恒温鼓风干燥箱,苏州豪顺自动化设备有限公司;DPH-9012/9032型电热恒温培养箱,上海一恒;BYC—A电子计重天平,深圳市博佳电子仪器有限公司;79-1磁力加热搅拌器,金坛市富华仪器有限公司。1.4 试验方法

1.4.1 水解度(DH)的测定[2]

用甲醛滴定法测定,公式:

水解度(DH%)=(打断肽键的数目/总肽键数)×100;水解度(DH)=(水解后生成的NH2基的量/样品总含N量)×100%

1.4.2 水解后生成的NH2基的测定

由甲醛滴定法测得,样品总含氮量由凯氏定氮法测定。

1.4.3 酸度的测定

用指示剂法测定食品中总酸(以乳酸计)。

1.4.4 三酶复合水解条件的确定[4-7]

采用正交实验方法,以水解度为测定指标,考察复合酶比例(A)、反应pH值(B)、反应温度(C)和反应时间(D)4个因素对水解度的影响。实验方案如表1。

1.4.5 乳酸菌发酵条件的确定[1,8]

采用正交实验法,以酸度(以乳酸计)为测定指标,酸度影响产品的色、香、味和稳定性,因此能更好的反映发酵的适宜条件[3]。考察反应温度(A)、接种量(菌种占大豆蛋白水解液百分比)(B)和反应时间(C)3因素对发酵酸度的影响。实验方案如表2。

1.4.6 产品配方优选实验

由5~8人组成感官评定小组,根据产品的粘稠度、清液析出状况、色泽、酸度、甜度、香味等方面的情况进行感观评分,采取10分制[8]。产品配方优选正交实验因素水平表如表3。发酵酸豆乳配方优选产品感官评定标准如表4。

2 结果与讨论

2.1 大豆蛋白液最佳水解条件的确定

采用单因素试验分析方法对3种酶的可控因素进行数据分析,以水解度为测定指标,考察其各自的蛋白酶用量、反应温度、反应时间和反应pH值4个因素对水解度的影响,确定可控因素的最佳范围。

2.1.1 中性蛋白酶水解的单因素分析

2.1.1.1 酶用量对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至7.0,分别加入500U·g-1、1000U·g-1、1500U·g-1、2000U·g-1、2500U·g-1中性蛋白酶,55℃下反应3h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图1所示,随酶用量的增加,DH呈上升趋势,在酶用量为2000U·g-1时最高。这主要是因为由于酶浓度过大发生自溶(自水解)现象,导致对底物水解作用减弱[9]。因此,最适酶用量为2000U·g-1。

2.1.1.2 温度对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至7.0,均加入2000U·g-1中性蛋白酶,分别在以下温度中进行反应:40℃、45℃、50℃、55℃、60℃,反应时间3h,终止酶解反应,测定水解度。

结果如图2所示,随反应温度的增加,在55℃时DH最高。温度对酶促反应的影响有2个方面,温度提高可使反应速度加快,随着温度的提高,酶失活速度也开始加快。因此,适宜反应温度为55℃。

2.1.1.3 时间对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至7.0,均加入2000U·g-1中性蛋白酶,在55℃下分别反应2h、3h、4h、5h、6h后,终止酶解反应,测定水解度。

结果如图3所示,随着反应时间的逐渐增加,DH呈上升趋势,在反应4h时DH最高。随着时间的延长,水解度的上升趋势应该趋于平缓,而图中显示有下降趋势,主要原因可能是水解液水解时间过长,多肽分子进一步分解,影响了水解度的测定[10]。综合考虑,适宜反应时间为4h。

2.1.1.4 pH对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,均加入2000U·g-1中性蛋白酶,在55℃下分别反应4h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图4所示,随pH的逐渐增加,DH呈上升趋势,在pH至7.0时DH开始下降。这是由于酶作为一种特殊的蛋白质分子,其酶催化反应的能力与环境pH值密切相关,环境pH值会影响酶分子的构像和酶分子及底物分子的解离状态,从而影响酶的活性和酶促反应速度,pH值过高、过低均对酶促反应不利。因此,最适pH为7.0。

2.1.2 木瓜蛋白酶水解的单因素分析

2.1.2.1 酶用量对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至7.0,分别加入6000U·g-1、7000U·g-1、8000U·g-1、9000U·g-1、10000U·g-1木瓜蛋白酶,55℃下反应3h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图5所示,随酶用量的增加,DH呈上升趋势,在酶用量为9000U·g-1以后增加不是很显著。因此,适宜的酶用量为9000U·g-1。

2.1.2.2 pH对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶,在55℃下分別反应3h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图6所示,随pH的增加,DH呈上升趋势,在pH至6.5时DH开始下降。由于pH过高、过低都会影响酶促反应,水解度最大时即为最佳pH。因此,最适pH为6.5。

2.1.2.3 时间对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至6.5,均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶,在55℃下分别反应2h、3h、4h、5h、6h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图7所示,随反应时间的增加,DH呈上升趋势。一般来讲,加酶量相同,时间越长,水解率越高,但达到一定的时间后上升趋势减缓,综合考虑到能耗、生产周期及防止水解液变质等因素,适宜反应时间为3h。

2.1.2.4 温度对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至6.5,均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶,分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反应3h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图8所示,随反应温度的增加,在55℃时DH最高。温度对酶促反应的影响主要是温度提高反应速度加快,但温度过高则会使酶失活加快,从而使水解度降低。因此,适宜反应温度为55℃。

2.1.3 菠萝蛋白酶水解的单因素分析

2.1.3.1 酶用量对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至6.5,分别加入1000U·g-1、2000U·g-1、3000U·g-1、4000U·g-1、5000U·g-1菠萝蛋白酶,55℃下反应4h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图9所示,随酶用量的增加,DH呈上升趋势,在酶用量为3000U·g-1以后增加趋势不是很显著。从经济效益考虑,适宜酶用量为3000U·g-1。

2.1.3.2 温度对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至6.5,均加入3000U·g-1菠萝蛋白酶,分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反应4h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图10所示,随反应温度的增加,在55℃时DH最高。随着温度的提高,酶促反应速率加快,但温度升高也加快了酶失活速率。因此,适宜反应温度为55℃。

2.1.3.3 时间对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH至6.5,均加入3000U·g-1菠萝蛋白酶,在55℃下分别反应2h、3h、4h、5h、6h后,终止酶解反应,测定水解度。结果如图11所示,随反应时间的增加,DH呈上升趋势,在反应时间为4h以后趋于平稳。一般来讲,要达到同样的水解率,水解时间同酶的用量有关,酶的用量大,水解时间可以短些。加酶量相同,时间越长,水解率越高,但达到一定的时间后上升趋势减缓,综合考虑到能耗、生产周期及防止水解液变质等因素,以水解时间不宜超过4h为宜。因此,适宜反应时间为4h。

2.1.3.4 pH对DH的影响

量取100mL的大豆蛋白液5份,调pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,均加入3000U·g-1中性蛋白酶,在55℃下分别反应4h后,终止酶解反应,测定水解度。

结果如图12所示,随pH的增加,DH呈上升趋势,在pH至6.5时DH开始下降。pH影响酶的活性和酶促反应速度,pH值过高、过低均对酶促反应不利。因此,最适pH为6.5。

2.1.4 三酶复合水解条件的确定

采用正交实验方法,以水解度为测定指标,考察复合酶比例(A),反应pH值(B),反应温度(C)和反应时间(D)4个因素对水解度的影响。实验数据如表5所示。

由表5可知,影响水解度的主次顺序:A>C>D>B,即蛋白酶比例>反应温度>反应时间>反应pH值;三酶复合酶解大豆蛋白的最佳水解条件是:A2B1C2D3,即中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和波萝蛋白酶的比例为1∶2∶4,反应温度55℃,反应时间4h,pH6.5,此条件下大豆蛋白液的水解度为42.12%。

2.2 接种乳酸菌发酵大豆蛋白水解液

2.2.1 乳酸菌发酵条件的确定

向所得的大豆蛋白水解液中接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌1∶1的比例进行乳酸发酵。采用正交实验法,以酸度(以乳酸计)为测定指标。考察反应温度(A)、接种量(菌种占大豆蛋白水解液百分比)(B)和反应时间(C)3因素对发酵酸度的影响。实验数据如表6所示。

由表6可以看出,对乳酸发酵影响的主次顺序为A>B>C,即温度>反应接种量>反应时间。选择最佳发酵条件是A1B2C2。即温度38℃,接种量4%,发酵时间为5h,菌种比1∶1。此时水解液乳酸发酵的酸度(以乳酸计)为0.82%。

2.2.2 产品配方优选实验

参考有关资料并结合乳酸菌发酵条件正交试验的结果,选取蔗糖、乳粉、稳定剂为正交试验的3个因素,各取3个水平,选用L9(33)正交表安排实验。由5~8人组成感官评定小组,根据产品的粘稠度、清液析出状况、色泽、酸度、甜度、香味等方面的情况进行感官评分,采取10分制[12]。产品配方优选正交实验因素水平感官评定结果分析如表7所示。

根据表7中计算的各指标均值的极差(R)可以看出,各因素对产品品质影响的主次顺序:A(蔗糖%)=D(稳定剂%)>B(乳粉%)。由水平均值(k)可以得出最优水平组为:A3B2C3,即蔗糖6%,乳粉4%,稳定剂0.9%。

3 结论

采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶三酶复合,对大豆蛋白进行酶解和乳酸发酵,研制出风味良好,易消化吸收的大豆多肽酸奶新产品。最佳酶解条件是中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的比例为1∶2∶4,反应温度55℃,反应时间4h,反应pH值为6.5;最佳发酵条件:温度38℃,反应接种量4%,发酵时间为5h,菌种比1∶1;最佳配方:蔗糖6%,乳粉4%,稳定剂0.9%。

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(责任编辑 李媛媛)