PI3K/Akt信号通路对高糖状态下视网膜Müller细胞的影响△

刘文强 冯闯 左中夫 刘学政

Müller细胞对维持视网膜稳态具有重要作用[1]。研究发现，高糖状态下会造成Müller细胞损伤甚至凋亡，进而导致视网膜功能紊乱，影响患者的视力[2]。因此，如何抑制Müller细胞凋亡显得尤为重要。PI3K/Akt信号通路是由磷脂酰肌3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)始动的生物信号转导通路，该通路与细胞周期调控、凋亡启动等密切相关，并在神经损伤中扮演重要角色[3]。而PI3K/Akt信号在高糖状态下对Müller细胞的影响尚不清楚。因此，本研究分别从动物实验和细胞水平探讨PI3K/Akt信号通路对高糖状态下视网膜Müller细胞的影响，为揭示糖尿病视网膜病变(DR)发病机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美国Sigma公司)；Müller细胞株(上海斯信生物公司)；大鼠视网膜神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)、p-Akt、NF-κB、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及β-actin抗体(英国Abcam公司)；HE试剂盒、TUNEL试剂盒、荧光及Western blot二抗(北京碧云天公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；冰冻切片机(德国SLEE公司)；水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1.1.2 实验动物及分组雄性SD大鼠40只，体质量180～220 g[购自锦州医科大学，SCXK(辽)2014-16]。将SD大鼠随机分成对照组、糖尿病组、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)(PI3K/Akt信号通路激活剂)组、IGF-1+LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)组，每组各10只。后三组采用单次腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)诱导糖尿病模型，72 h后检测尾静脉血糖，将血糖>16.7 mmol·L-1的大鼠作为糖尿病模型大鼠。模型诱导成功后，依据文献[4]，IGF-1组给予IGF-1 (80 μg·L-1)5 μL玻璃体内注射给药(双侧眼球均给药)，IGF-1+LY294002组玻璃体内给予5 μL(IGF-1+ LY294002)(80 μg·L-1)，两组均每周注射一次，均进行四次操作。对照组、糖尿病组注射等剂量PBS缓冲液。玻璃体内注射给药步骤为：40 g·L-1戊巴比妥钠溶液(60 mg·kg-1)将大鼠麻醉，固定在超净工作台内，20 g·L-1碘伏消毒眼部皮肤。在解剖显微镜下用微量进样器取5 μL相应注射液于角膜缘后1.0 mm进针处注入大鼠玻璃体内。实验过程中剔除发生眼球萎缩等并发症的大鼠。3 个月后进行各项指标检测。

1.1.3 细胞培养及分组将Müller细胞株置于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱(DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清)中培养，当细胞融合至80%左右时传代。参照文献[4]，24 h后给予不同处理后进行分组培养，分为对照组(空白对照)、高糖组(30 mmol·L-1葡萄糖)、IGF-1组(30 mmol·L-1葡萄糖+80 μg·L-1IGF-1)、IGF-1+LY294002组[30 mmol·L-1葡萄糖+80 μg·L-1(IGF-1+ LY294002)]，四组均给予DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清进行培养，并于培养3 d后检测相关指标。

1.2 方法

1.2.1 样本制备大鼠末次玻璃体内注射后3个月，每组取5只大鼠使用40 g·L-1多聚甲醛灌注处死后取出眼球，300 g·L-1蔗糖溶液脱水，OCT包埋后切片，厚度为10 μm，4 ℃保存，用于HE染色、免疫荧光染色。

1.2.2 HE染色检测视网膜内核层细胞密度切片浸于PBS洗涤3次，每次3 min；滴加苏木素作用2 min；PBS洗涤1 min，自来水冲洗；体积分数95%酒精作用1 min；伊红浸染2 min，自来水冲洗；封片后拍照，应用Image J 软件计数视网膜内核层(inner nuclear layer,INL)细胞密度。

1.2.3 免疫荧光检测大鼠视网膜GFAP表达及Müller细胞Caspase-3蛋白表达切片及置于35 mm 培养皿里的细胞，PBS洗3次；40 g·L-1多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次；体积分数0.2%Triton X-100通透10 min，PBS洗3次；山羊血清封闭30 min，PBS洗3次；一抗(兔抗大鼠GFAP，1300；兔抗大鼠Caspase-3，1500)4 ℃过夜，PBS洗3次；山羊抗兔A488荧光二抗室温封闭45 min(避光)，PBS洗3次；封片后拍照观察，应用Image J软件分析荧光强度。

1.2.4 TUNEL染色检测Müller细胞凋亡情况细胞用PBS洗1次；40 g·L-1多聚甲醛固定30 min；PBS洗1次，加入含体积分数0.1% Triton X-100的PBS冰浴2 min；TUNEL检测液的配制：末端转移酶与荧光标记液比例为124。PBS洗2次，样品加50 μL TUNEL检测液，37 ℃孵育60 min；PBS洗3次，封片后拍照观察。

1.2.5 Western blot检测Müller细胞p-Akt、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量BCA法测定蛋白浓度，确定电泳时加入15 μL样品；电泳、转膜后10 g·L-1BSA室温封闭2 h；加入一抗(兔抗大鼠p-Akt，15000；兔抗大鼠NF-κB，110 000；兔抗大鼠Caspase-3，18000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗4次，每次5 min；加入二抗室温2 h，TBST洗4次，每次5 min；化学发光法(ECL)显影，Image J软件分析灰度值。

1.3 统计学方法统计分析采用SPSS 20.0 统计学软件进行，整体比较采用F检验，两两比较采用LSD检验，所有数据均以均数±标准差表示，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 动物实验

2.1.1 HE染色结果四组INL细胞密度相比，差异具有统计学意义(F=326.41，P<0.05)。与对照组相比，糖尿病组及IGF-1+LY294002组INL细胞密度均明显降低(均为P<0.05)；与糖尿病组相比，IGF-1组INL细胞密度明显增加(P<0.05)，而IGF-1+LY294002组与糖尿病组INL细胞密度比较，差异无统计学意义(P>0.05) (见表1与图1)。

表1 各组大鼠视网膜INL细胞密度及GFAP表达

图1 各组大鼠视网膜HE染色 GCL：视网膜神经节细胞层(×400)

2.1.2 免疫荧光检测视网膜GFAP表达四组视网膜GFAP表达相比，差异具有统计学意义(F=863.25，P<0.05)。与对照组相比，糖尿病组及IGF-1+LY294002组GFAP表达均明显增加(均为P<0.05)；与糖尿病组相比，IGF-1组GFAP表达明显降低(P<0.05)，而IGF-1+LY294002组与糖尿病组GFAP表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1与图2)。

图2 各组大鼠视网膜GFAP表达(×400)

2.2 细胞实验

2.2.1 各组Müller细胞状态与对照组相比，高糖组及IGF-1+LY294002组Müller细胞生长缓慢，胞体肿胀，细胞边缘折光性增强。与高糖组相比，IGF-1组Müller细胞状态有所改善(见图3)。

2.2.2 免疫荧光染色检测Müller细胞Caspase-3蛋白表达将对照组Caspase-3荧光强度设定为100.00%，四组Caspase-3蛋白表达相比，差异具有统计学意义(F=1208.34，P<0.05)；与对照组相比，高糖组及IGF-1+LY294002组Caspase-3表达均明显增加(均为P<0.05)；与高糖组相比，IGF-1组Caspase-3表达明显降低(P<0.05)(见表2与图4)。

图3 各组Müller细胞生长状态(×400)

表2 各组Müller细胞Caspase-3表达、凋亡率及 p-Akt、Caspase-3、NF-κB相对表达水平

图4 免疫荧光检测各组Müller细胞Caspase-3蛋白表达(×200)

2.2.3 TUNEL染色检测Müller细胞凋亡情况应用Image J软件计数Müller凋亡细胞数量并转换为凋亡率，结果显示，四组Müller细胞凋亡率相比，差异具有统计学意义(F=261.43，P<0.05)。与对照组相比，高糖组及IGF-1+LY294002组Müller细胞凋亡率均明显增加(均为P<0.05)，而与高糖组相比，IGF-1组Müller细胞凋亡率明显下降(P<0.05)(见表2与图5)。

图5 TUNEL染色检测各组Müller细胞凋亡(×200)

2.2.4 Western blot 检测各组Müller细胞p-Akt、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量四组Müller细胞p-Akt、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量相比，差异均具有统计学意义(F=879.26、635.12、716.42，均为P<0.05)。与对照组相比，高糖组及IGF-1+LY294002组p-Akt蛋白相对表达均明显下降，NF-κB、Caspase-3 蛋白相对表达均明显增加(均为P<0.05)；而与高糖组相比，IGF-1组p-Akt蛋白相对表达明显增加，NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达均明显下降(均为P<0.05)(见表2与图6)。

图6 Western blot检测各组Müller细胞p-Akt、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量

3 讨论

目前糖尿病患者与日俱增，据统计，我国成人中糖尿病发病率高达9.70%[5]，随着患者病程的延长，若得不到及时有效的防治，常引起DR。目前针对DR的基础探索及药物开发甚至临床上对DR的诊断和治疗多围绕微血管病变[6-7]，但仅仅针对微血管病变进行防治DR却并没有取得令人满意的效果。研究发现，Müller细胞在DR神经病变中至关重要[2]， Müller细胞凋亡增加不仅导致微血管病变，亦造成神经损伤[8]。GFAP为一种中间丝结构蛋白，在Müller细胞内的过度表达可损伤视网膜神经元。本研究动物实验发现，糖尿病状态下视网膜GFAP表达明显增加，INL细胞密度明显下降，这提示Müller细胞的过度活化可能引起INL细胞密度降低。而Müller细胞的细胞核主要分布在INL，有研究发现，DR大鼠16周时，会出现Müller细胞数量明显降低、INL变薄等改变[9]，这与本课题组前期研究结果相一致[10]，推测INL细胞密度的减少可能由于Müller细胞凋亡引起。因此，本研究进一步做了细胞实验，对正常的Müller细胞株进行高浓度葡萄糖处理进而模拟DR时Müller细胞的损伤状态，结果发现，高糖状态下，Müller细胞生长缓慢，胞体肿胀，最终会引起Müller细胞凋亡。因此，如何抑制Müller细胞凋亡对防治DR尤为重要。

PI3K/Akt为经典的细胞存活信号通路。有文献报道，激活Akt通路可对抗氧化应激损伤引起的小鼠原代神经元凋亡[11]。而本研究动物实验发现，糖尿病状态下给予IGF-1后，GFAP表达明显下降，INL细胞密度明显增加。而在IGF-1组基础上给予LY294002后，IGF-1的保护作用被逆转。对Müller细胞进行高浓度葡萄糖刺激的基础上给予IGF-1后，细胞生长状态较高糖组明显改善，Müller细胞凋亡率明显下降。而在IGF-1组基础上给予LY294002后，IGF-1的保护作用同样被逆转。研究证实，PI3K/Akt通路保护神经元存活的机制[12]主要包括：(1)可调控神经生长因子的分泌进而保护神经元；(2)可抑制下游Caspase、p53、cREB和FHKRLl等蛋白的表达对抗细胞凋亡；(3)通过线粒体通路干预神经元凋亡；(4)通过红细胞生成素/红细胞生成素受体系统保护神经元。NF-κB为PI3K/Akt通路下游的重要因子，其表达上调可诱导Müller细胞的凋亡[13]。Caspase 家族为重要的凋亡信号分子，而Caspase-3在该家族中占有重要的地位[14]。Caspase-3通过激活DNase、酶切PARP片段化等一系列机制，造成细胞凋亡[15]。本研究发现，高糖环境下培养的Müller细胞NF-κB、Caspase-3蛋白表达明显升高，而给予IGF-1后NF-κB、Caspase-3蛋白表达明显下降。这提示，激活PI3K/Akt信号可抑制高糖环境下培养的Müller细胞凋亡，其作用机制可能与下调NF-κB、Caspase-3的表达有关。

综上所述，本研究发现激活PI3K/Akt通路可对抗糖尿病大鼠视网膜INL细胞的减少，亦可抑制高糖引起的Müller细胞凋亡，其作用机制与下调NF-κB、Caspase-3蛋白表达有关。但因DR致病机制复杂，IGF-1的临床价值仍需更深入的研究。