siRNA 沉默HIF-1α 基因联合经导管动脉栓塞术对兔VX2 肝癌模型疗效及微循环的影响

戴琦 刘日 闫昆 郑建军 张景峰

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一。近年来在肝癌治疗领域的重要进展之一是确立了以经导管动脉内栓塞/化疗栓塞（transcatheter arterial embolization/chemoembolization，TAE/TACE）为代表的介入治疗在肝癌综合治疗中的重要地位［1］。然而HCC 在栓塞治疗后发生缺血缺氧、坏死的同时，肿瘤也在对缺氧微环境进行适应［2］。TAE 加重缺氧微环境进而诱导肝癌细胞缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α） 基因表达上调，HIF-1α 升高通常促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的过度表达，促进血管内皮细胞增殖，抑制血管内皮细胞凋亡，最终刺激肿瘤细胞的增殖［3,4］。如何有效地阻断肿瘤缺氧应答，已是TAE 所面临的亟待解决的问题之一。近年来，小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）的发现与应用是基因治疗领域的重要进展，为包括肝癌在内的多种肿瘤靶向治疗提供了新的手段。

本研究动物实验经浙江省医学科学院动物伦理委员会批准。通过建立兔肝VX2 肿瘤模型，检测不同治疗方案组的肿瘤组织HIF-1α、VEGF 基因及蛋白表达水平，探讨TAE 联合RNA 干扰HIF-1α 治疗对兔肝VX2 肿瘤模型的疗效和微循环的影响。

资料与方法

1.材料

实验动物：严格遵照《关于善待实验动物的指导性意见》妥善处理实验动物。VX2 荷瘤兔由浙江大学实验动物中心提供。新西兰大白兔购自浙江省医学科学院实验动物中心［生产许可证号：SCXK（浙）2010-0047，合格证号：0017865、0017867、0017870］，24 只雄性，2～3 个月龄，体重2.0～2.5 kg。实验动物房［使用许可证号SYXK（浙）2015-0008］的饲养环境为温度范围20℃～25℃，相对湿度范围40%～70%。实验前兔在动物房环境中适应6 d，单笼饲养。

主要试剂与仪器：HIF-1α 靶向短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）片段（上海桑尼生物科技）；高纯度质粒小量中提试剂盒（北京天根生化）；Qiagen 大规模质粒抽提试剂盒（Qiagen 公司）；0.9%氯化钠注射液；注射用青霉素钠（华北制药）；戊巴比妥钠（Sigma-Aldrich 分装）；碘对比剂（Omnipaque 350；GE Healthcare）；血管鞘、Cobra导管、同轴微导管（Terumo）；1.5 T MR 扫描仪、C臂X 线机（GE Healthcare）；光学显微镜（Olympus BX53）。

2.方法

HIF-1α shRNA 的合成与鉴定：构建HIF-1αshRNA 慢病毒载体，提取质粒，用shHIF-1α 质粒转染293a 细胞，收获腺病毒。腺病毒感染原代兔皮肤成纤维细胞48 h 后，荧光定量PCR 检测HIF-1α 信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表达，验证病毒的敲降效率，筛选出HIF-1α 基因敲降效率最高的shRNA 作为目标HIF-1α shRNA。

兔VX2 肝癌模型造模与验证：从荷瘤兔中取出VX2 瘤株，选择生长好的实性部分裁剪成1 mm3左右组织块。实验兔麻醉、开腹、暴露肝脏后将肿瘤组织块植入肝左叶，用明胶海绵块压迫穿刺点止血，还纳肝脏入腹腔，逐层缝合腹壁肌肉和皮肤。术后保温至麻醉苏醒后，放回笼中分开饲养，每日肌注青霉素160 万U，连续三天。术后两周，全麻下行MRI 检查，使用Siemens 1.5 T MR扫描仪，腰椎8 通道线圈，采集常规T1WI、T2WI及DWI 数据（图1），证实肿瘤种植是否成功。并且符合以下条件纳入试验：肿瘤位于肝实质内，最大径小于3 cm，信号较均匀，坏死灶小于瘤体直径的1/2。

分组与治疗：所有入组模型兔按随机数字表分为A、B、C、D 共4 组，肿瘤种植第14 天，MRI 证实肿瘤种植成功后，将模型兔用1%戊巴比妥钠（3 ml/kg）耳缘静脉麻醉，当日在DSA 下行介入栓塞操作（图2）。A 组：TAE 组，动脉内注入PVA 微粒与对比剂混悬液；B 组：HIF-1α-shRNA 组，动脉内灌注HIF-1α-shRNA 溶液；C 组：TAE+HIF-1α-shRNA 组，动脉内灌注PVA 微粒与对比剂混悬液及HIF-1α-shRNA 溶液；D 组：对照组，灌注生理盐水。具体步骤如下：股动脉穿刺成功后，引入4F 血管鞘（Terumo）；先采用4F Cobra（Terumo）导管选择性插入腹腔干，手推对比剂Omnipaque 350 总量3 ml，流率约0.5 ml/s，进行腹主动脉造影以了解肝脏血管解剖；再采用2.7 F 同轴微导管（Terumo）超选择性插入肝左动脉内，DSA 造影证实移植瘤由肝左动脉供血，然后对每组动物进行相应处理。TAE 组、TAE+HIF-1α-shRNA 组动物在DSA 透视导向下，小心将预先制备的混悬液注入肝左动脉，栓塞程度以肿瘤供血动脉血流的完全停滞为准；HIF-1α-shRNA 组溶液注入量基于入选动物的体重（0.6 nmol/g）；对照组注入生理盐水2 ml。

取材与检测指标：分别于介入术前（造模后第14 天）、介入术后第14 天4 组模型兔各随机处死3 只，取VX2 肿瘤行病理学与免疫组织化学检查、实时定量PCR 分析。观察各组VX2 肿瘤组织HIF-1α 和VEGF 的蛋白和mRNA 表达水平。

3.病理图像分析

HE 染色切片于100 倍显微镜镜下观察肝癌组织坏死区面积及核分裂像总数，200 倍及400倍镜下观察细胞的形态与结构。每张免疫组织化学切片于100 倍镜下随机选择3 个不同的视野观察和计数，取每张切片的均值作为每例的测量值。测量结果由本单位2 位资深病理学医生确认。

4.统计学处理

结 果

1.实验动物一般性观察

实验兔肝VX2 肿瘤造模后饮食减少，活动减少，3 d 基本恢复。移植2 周肿瘤直径可达1 cm 左右，移植4 周肿瘤直径可达2～3 cm，肿瘤中心出现坏死。实验过程中造模兔无脱失，全部纳入结果分析。

2.病理标本HE 染色

显微镜镜下按肝癌组织坏死区面积及核分裂象总数进行坏死级别评分：（1）坏死程度按坏死面积占组织面积的百分比X 评级，分为“+”为X<10%；“++”为10%60%；（2）100 倍镜下计算肿瘤区域核分裂像总数。

TAE 联合HIF-1α 靶向的siRNA 动脉内灌注组较其余各组组织坏死更严重，肿瘤细胞核分裂像减少，提示该处理方式对肿瘤疗效更好（表1、图3）。

3.病理标本免疫组织化学染色

图1 兔VX2 肿瘤移植后两周后T1WI、T2WI 及DWI 表现。a)MR T1WI 示肿瘤呈类圆形低信号，边界模糊（箭）；b)T2WI 示肿瘤呈稍高信号，边界光整锐利（箭）；c)DWI 示肿瘤呈明显均匀高信号，显示清晰（箭） 图2 兔肝VX2 移植瘤DSA 各期图像。a)动脉期减影图示肿瘤供血动脉增粗、迂曲，局部血管结构紊乱；b)实质期减影图示肿瘤染色明显；c)实质期未减影图示肿瘤染色；d)栓塞治疗后DSA 未减影图示肿瘤内栓塞物质沉积良好

表1 HE 染色观察VX2 肿瘤组织病理学改变（介入术后第14 天）

染色结果采用半定量分析方法：以染色强度结合阳性细胞数百分比进行评分。染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0 分，轻微为1 分，中度为2 分，重度为3 分。阳性细胞百分比即每张免疫组织化学切片选择3 个不同的视野（×200）观察：0～5%分评为0 分，6%～25%评1 分，26%～50%评2 分，51%～75%评3 分，>75%均评为4 分。对每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比评分，最终评分以阳性细胞百分比与染色强度的加和：0 分为阴性（-），1～3 分为弱阳性，4～5 分为中度阳性，6～7 分为强阳性。

应用S-P 免疫组织化学法检测各组肿瘤HIF-1α 蛋白和VEGF 蛋白表达，阳性染色为呈淡黄色、黄色、棕黄色颗粒，HIF-1α 蛋白定位于细胞核和胞浆，以胞核为主；VEGF 蛋白定位于细胞浆。与对照组、TAE 组、HIF-1α-shRNA 组相比，TAE+HIF-1α-shRNA 组能 显著抑制HIF-1α 和VEGF的蛋白表达（PHIF-1α<0.001；PVEGF<0.001）。具体结果见表2、图4、5。

4.病理标本RT-PCR 定量分析

图3 实验组与对照组兔肝VX2 肿瘤组织HE 染色（×100）。a)单纯TAE 治疗组，示肿瘤细胞排列稀疏，少部分细胞坏死，坏死级别为+++；b)HIF-1α-shRNA 治疗组，示肿瘤细胞排列较为紧密，少数细胞坏死，坏死级别为+++；c)TAE 联合HIF-1α-shRNA 治疗组，细胞坏死程度较单纯TAE 治疗组更为显著，坏死级别为++++；d)空白对照组，示肿瘤细胞异型性明显，瘤巢结构丰富，坏死级别为+～++

图4 免疫组织化学检测实验组与对照组兔肝VX2 肿瘤组织HIF-1α 蛋白表达（×100，S-P）。第一行分别为单纯TAE 治疗组、HIF-1αshRNA 治疗组、TAE 联合HIF-1α-shRNA 治疗组和空白对照组术前的HIF-1α 蛋白表达，主要位于胞核，均为中度阳性（阳性细胞百分比评分2 分，染色强度评分2 分）；第二行分别为单纯TAE 治疗组、HIF-1α-shRNA 治疗组、TAE 联合HIF-1α-shRNA 治疗组和空白对照组术后的HIF-1α 表达情况，分别为强阳性（阳性细胞百分比评分3，染色强度4 分）、中度阳性（阳性细胞百分比评分2 分，染色强度评分3 分）、弱阳性（阳性细胞百分比评分1 分，染色强度评分1 分）和强阳性（阳性细胞百分比评分3 分，染色强度评分4 分）

图5 免疫组织化学检测实验组与对照组兔肝VX2 肿瘤组织VEGF 蛋白表达（×100，S-P）。第一行分别为单纯TAE 治疗组、HIF-1αshRNA 治疗组、TAE 联合HIF-1α-shRNA 治疗组和空白对照组术前的VEGF 蛋白表达，主要位于细胞浆，均为中度阳性（阳性细胞百分比评分2 分，染色强度评分2 分）；第二行分别为单纯TAE 治疗组、HIF-1α-shRNA 治疗组、TAE 联合HIF-1α-shRNA 治疗组和空白对照组术后的HIF-1α 表达情况，分别为强阳性（阳性细胞百分比评分4，染色强度4 分）、中度阳性（阳性细胞百分比评分2 分，染色强度评分2 分）、弱阳性（阳性细胞百分比评分1 分，染色强度评分1 分）和强阳性（阳性细胞百分比评分3 分，染色强度评分3 分）

图6 不同实验组兔肝VX2 肿瘤组织HIF-1α 基因表达情况，以兔GAPDH 为内参（*P<0.001） 图7 不同实验组兔肝VX2 肿瘤组织VEGF 基因表达情况，以兔GAPDH 为内参（*P<0.001）

该实验结果由实时荧光定量PCR 分析软件BIO-RAD CFX Manager 自动进行统计和计算，并生成相应的PDF 文档和Excel 原始数据文件。TAE+HIF-1α-shRNA 组的HIF-1α、VEGF mRNA表达水平明显低于其余各组（P<0.001）。HIF-1α、VEGF 相对表达结果如图6、7 所示。

讨 论

以栓塞为基础的TAE/TACE 是目前公认的治疗手术不可切除肝癌的主要方法。但是，HCC 在栓塞治疗后发生缺血缺氧、坏死的同时，肿瘤自身也在对缺氧微环境进行适应。既往有研究［5］将VX2 肿瘤植入新西兰大白兔肝脏，在VX2 肝移植瘤中发现HIF-1α 表达，且栓塞后病灶中的HIF-1α 表达明显增加。Virmani 等［6］建立肝脏VX2 肿瘤模型并在TAE 前及TAE 后10 min 行超声引导下活检，结果显示TAE 引起的缺氧激活HIF-1α表达。Liang 等［7］对兔VX2 肝癌模型进行TAE 治疗，结果提示VX2 肿瘤内缺氧导致HIF-1α 过度表达，该过程的产生参与了TAE 相关肿瘤血管生成的激活。因此，鉴于HIF-1α 在肿瘤细胞缺氧应答中的关键作用及其与肿瘤血管生成的关系，HIF-1α 已成为有潜力的肿瘤治疗新靶点［8］。基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因受内源或外源性因素影响，不表达或者是表达减少的现象，是近年来基因治疗领域的重要发现，为肿瘤基因水平靶向调控与治疗提供了新思路［9］。根据其作用机制和水平不同可分为三种：位置效应、转录水平和转录后水平。其中，转录后水平基因沉默是siRNA 水平基因调控的结果，不与染色体DNA相互作用，具有诱导靶细胞基因改变或突变风险较低，对靶基因特异度高，毒性低等优点［10,11］。通过基因沉默或干扰HIF-1α 基因阻断以TAE 治疗后的肿瘤缺氧适应，抑制的肿瘤血管生成，对肝癌综合治疗具有新应用前景［12,13］。

表2 免疫组织化学检测肝癌组织HIF-1α 和VEGF

鉴于兔VX2 肿瘤以组织块冷冻保存或活体传代，无法获取VX2 瘤细胞株进行培养，因此本研究选取原代兔皮肤成纤维细胞作为腺病毒感染的对象，从而保证了目的基因用于荷瘤动物治疗的同源性。在此基础上，成功构建shHIF-1α 质粒并转染293a 细胞，收获腺病毒，通过荧光定量PCR 检测HIF-1α mRNA 表达验证了腺病毒具备较高的敲降效率，研究结果与已有的文献报道一致［14］。由于HIF-1α 的过度表达主要是由缺氧引起的，为避免化学药物的影响，本研究采用TAE代替TACE，结果发现TAE 组术后14 d 肿瘤组织 内HIF-1α、VEGF 基因的mRNA 表达水平（P<0.001）、蛋白表 达水平（P<0.001）较术前 显著增加，这与之前的研究结果一致［5-7］，说明TAE 引起肿瘤缺氧微环境会进一步诱导HIF-1α 基因表达增加，激活相关靶基因（VEGF）促进肿瘤血管生长。TAE 组、HIF-1α-shRNA 组术后14 d 的肿瘤病理切片坏死评分均明显低于TAE+HIF-1αshRNA 组，表明单纯TAE 治疗或者单纯抑制HIF-1α 基因的表达并不能有效地抑制肿瘤组织对缺氧环境的应答。

本研究中HIF-1α-shRNA 组术后HIF-1α、VEGF 基因表达水平低于对照组（P<0.001），反映HIF-1α-shRNA 在一定程度上抑制了肿瘤因自身生长供血不足引发的缺氧微环境应答，但其治疗效果不如TAE 联合HIF-1α-shRNA 效果显著。笔者分析其原因：第一，TAE 闭塞肿瘤供血动脉，导致肿瘤区域血流动力学改变，使HIF-1α-shRNA慢病毒载体在肿瘤组织内更长时间停留，提高转染效率；第二，TAE 造成缺氧微环境诱导HIF-1α高表达，与此同时HIF-1α-shRNA 有效地抑制肿瘤HIF-1α 的表达，从而有效地抑制肝癌组织中新生血管的形成，由于癌细胞的持续缺氧、坏死和凋亡，TAE 疗效将显著提高，肝癌的复发率将大大降低。这与Liao、Ni 等［2,3］研究结果一致，HIF-1α的低表达对TACE 预防肿瘤复发转移具有重要意义，随着HIF-1α mRNA 表达的沉默，癌细胞处于低氧、低代谢状态，从而导致癌细胞死亡［4,15］。

HIF-1α 在肿瘤组织缺氧适应中起关键作用，调控多种肿瘤免疫因子表达，如VEGF、IL-6、IL-8及TNF-α 等［16］。其中VEGF 是作用最强、特异性最高的血管生成调控因子［17,18］，由肿瘤细胞产生并分泌，可促进毛血管内皮细胞分裂和出芽生长，诱导新生血管形成，提高微血管通透性，降低肿瘤细胞的同质黏附性。同时，VEGF 可上调BCL-2 的表达，抑制肿瘤凋亡，与肿瘤预后密切相关［19］。因此，本研究着重探讨HIF-1α 基因沉默联合经导管栓塞术治疗对兔肝VX2 肿瘤模型疗效及肿瘤组织HIF-1α 和VEGF 表达的影响。结果发现TAE 组中肿瘤组织HIF-1α 和VEGF 的表达在介入治疗后14 d 显著增加，说明TAE 所致的缺氧会促进肝癌肿瘤组织HIF-1α 和VEGF 的形成。而HIF-1α-shRNA 组与TAE+HIF-1α-shRNA 组的HIF-1α 和VEGF 表达在介入治疗后14 d 显著降低，后者幅度更大，表明TAE 联合HIF-1α-shRNA能显著抑制缺氧后肝癌肿瘤组织HIF-1α 和VEGF 的蛋白表达。Wang 等［20］的一篇体外细胞实验报道在缺氧肿瘤微环境中，HIF-1α 通过LOXL2上调促进HCC 的VEGF 的表达。Chen 等［21］报道蜂毒肽可以通过抑制HIF-1 表达来抑制缺氧后HCC 的形成和EMT α/Akt 信号通路。但HIF-1α调控HCC 的VEGF 表达机制仍未完全阐明，有待进一步研究。

本研究尚存在一定的局限性：（1）兔肝VX2肿瘤为种植瘤模型，可能与肝脏原位癌存在差异；（2）只选取了介入治疗后第14 天（肿瘤倍增高峰期）为观察点，未获得肿瘤组织早期连续变化情况；（3）实验样本数量偏小，需扩大样本量进一步验证。

综上所述，TAE 联合HIF-1α-shRNA 可通过抑制TAE 治疗后兔肝VX2 肿瘤细胞中HIF-1α和VEGF mRNA 的表达水平，显著提高TAE 治疗兔肝VX2 肿瘤的疗效，为HCC 综合治疗提供了新的思路。