粪大肠菌群多管发酵法测定中复发酵试验的分析

温静梅

(山西省太原生态环境监测中心，山西 太原 030002)

引 言

粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。在44.5 ℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。通过研究发现，当适当提高培养温度时，在自然环境中可以生长的大肠菌群将不再生长，培养出的菌群主要是来自粪便中的大肠菌群，这样可以更为准确地反映出水质受粪便污染的情况[1]。多管发酵法作为目前环境监测实验中测定水质粪大肠菌群的一种常见方法，受到人们广泛探讨和研究。张少峰等[2]归纳了检测粪大肠菌群发酵法、滤膜法、酶底物法、聚合酶链式反应技术、荧光原位杂交技术、自动化检测方法等的优缺点及研究进展。吕琦等[3]按照多管发酵标准法稀释接种水样，不经过初发酵，直接接种在EC培养基中，在44.5 ℃水浴中培养24 h，然后与多管发酵标准法得到的结果对比，结果极为一致，得出直接用EC培养基培养法测定地表水中粪大肠菌群数可行，有很好的实用性。王朝霞[4]概述了多管发酵法的检测意义、发展历程，由不确定度引出的质量控制探讨，以及滤膜法、纸片法、酶底物法等检测方法的优缺点，说明多管发酵法是检测粪大肠菌群的经典方法。王晓雯等[5]对地表水、海水水样中多管发酵法测定粪大肠菌群过程中不确定度进行分量计算，建立简单的多管发酵法不确定度评定方法，得出人员操作中重复检测和随机性是不确定度的主要来源。张贵刚等[6]主要从培养基称量配置过程中、取样稀释过程中、培养基发酵阳性管比例中引入的不确定度评定粪大肠菌群多管发酵法。

本文根据《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法》(HJ 347.2-2018)测定地表水中粪大肠菌群，归纳总结针对初发酵后的不同实验现象进行复发酵试验及分析。首先根据《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法》(HJ 347.2-2018)标准进行样品接种、初发酵，在此基础上总结初发酵后的不同实验现象，并进行复发酵试验，最后主要介绍实验结论。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

采样瓶；立式压力蒸汽灭菌器：115 ℃、121 ℃可调；数显电热培养箱：允许温度偏差37(±0.5) ℃；电热恒温培养箱：允许温度偏差44(±0.5)℃；pH计：准确到0.1；接种环：直径3 mm；试管：20 mL、10 mL；乳糖蛋白胨培养液：准确称取乳糖蛋白胨试剂23 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中，充分混匀，分装于含有倒置小玻璃管的试管中，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，储存于冷暗处备用；三倍乳糖蛋白胨培养液：准确称取乳糖蛋白胨试剂69 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中，充分混匀，分装于含有倒置小玻璃管的试管中，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，储存于冷暗处备用；EC培养液：准确称取EC试剂23 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中，充分混匀，分装于含有倒置小玻璃管的试管中，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，储存于冷暗处备用；无菌水：去离子水经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.2 样品前期处理

1.2.1 样品接种

准备5支已灭菌、装有5 mL三倍乳糖蛋白胨培养液和10支已灭菌、装有10 mL单倍乳糖蛋白胨培养液的试管，在无菌环境下，混匀样品，分别向5支装有5 mL三倍乳糖蛋白胨培养液的试管中加入10 mL水样，向5支装有10 mL单倍乳糖蛋白胨培养液的试管分别加入1 mL水样，向5支装有5 mL单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中加入0.1 mL水样。

1.2.2 初发酵

将接种好的15支试管放入37(±0.5)℃的数显电热培养箱中培养24(±2)h。

1.3 复发酵试验

1.3.1 不同实验现象总结

在利用多管发酵法测定地表水粪大肠菌群实验过程中发现，水样在37(±0.5) ℃的数显电热培养箱中初次发酵培养24(±2) h后，会出现不同的实验现象，具体情况如下：

1) 初发酵试管颜色未发生变化，仍为浅紫色。

2) 初发酵试管上半管仍为浅紫色，下半管变成黄色；小玻璃倒管中气泡不明显，轻拍试管，无小气泡升起。

3) 初发酵试管上半管仍为浅紫色，下半管变成黄色；小玻璃倒管中有明显气泡。

4) 初发酵试管颜色由浅紫色变为黄色，说明产酸；小玻璃倒管中气泡不明显，轻拍试管，无小气泡升起。

5) 初发酵试管颜色由浅紫色变为黄色，说明产酸；小玻璃倒管中气泡不明显，轻拍试管，有小气泡升起。

6) 初发酵试管颜色由浅紫色变为黄色，说明产酸；小玻璃倒管中有明显气泡，则表明为阳性。

不同实验现象统计见表1。

表1 不同实验现象统计

针对以上6种不同的实验现象，均进行了复发酵试验，具体试验设计如表2。6种不同的实验现象，均进行了2个空白试验，2个同等条件下的EC培养基接种。其中，在正常情况下，出现现象1) 则不需要进行复发酵，本实验对其也进行复发酵试验，目的是将其与空白对照结合，共同质量控制。复发酵试验的主要过程是，轻微振荡试管，用经火焰灼烧并冷却后的接种环在试管中获取培养物，并将其接种在装有已灭菌的EC培养基试管中，放入44.5(±0.5)℃的电热恒温培养箱培养24(±2)h，培养后，若EC培养基小倒管未产气，则说明粪大肠菌群为阴性，若小倒管产气，则说明粪大肠菌群为阳性。针对现象1～现象6进行的试验，以下分别称之为实验1～实验6。

表2 不同实验现象的复发酵试验设计

1.3.2 试验结果

试验1中，2个空白对照、2个平行的EC培养基小倒管均未产气，为阴性；试验2中，2个空白对照、2个平行的EC培养基小倒管也均未产气，为阴性；试验3～实验5中，复发酵结果分两种情况：有的情况是2个空白对照、2个平行的EC培养基小倒管均未产气，为阴性；有的情况是2个空白对照试验未产气，而2个平行的EC培养基小倒管均产气，为阳性；试验6中，2个空白对照试验未产气，2个平行的EC培养基小倒管均产气，为阳性。

2 结果分析

当初发酵未产酸产气，则为阴性，无需进行复发酵试验；当初发酵试管呈上半管为浅紫色，下半管变成黄色，则需要重点观察是有否有气泡产生，一般无气泡的为阴性，有气泡则需进行复发酵试验进一步确定，因为有时候小倒管里不是初发酵产生的气泡，是自身空气未排空；初发酵试管颜色由浅紫色变为黄色，小玻璃倒管中气泡不明显，为疑似阳性，需要进一步进行复发酵试验，试验结果有可能是阳性，也有可能是阴性；初发酵试管颜色由浅紫色变为黄色，小玻璃倒管中气泡不明显，轻拍试管，有小气泡升起，也需进行复发酵试验进一步确定；初发酵试管颜色由浅紫色变为黄色，小玻璃倒管中有明显气泡，则表明为阳性，但也需要进行复发酵试验验证。总之，初发酵出现现象3～现象6时，仍需进行复发酵试验，进一步确定粪大肠菌群是否为阳性。

3 结语

多管发酵法测定地表水中粪大肠菌群时，初发酵后在产酸产气方面会出现不同的实验现象，针对不同的实验现象需分情况处理，有的可以直接确定粪大肠菌群为阴性，有的则需进行复发酵试验，从而进一步确定粪大肠菌群是否为阳性，这样才能更好、更准确地得出实验结果。