超声波辅助闪式提取美人松松针中皂苷的研究

王露瑶，迟雨昇，刘怡辰，霍云博，杨 萍

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

美人松别名吉林长白松，长白山稀有的松科植物之一，其松针提取物可广泛应用于医疗、美容、保健和食品等多种应用途径，可提高机体免疫力及用于增强体内荷尔蒙和肾上腺激素的平衡分泌，快速改善心肌缺血和缺氧，并且用于治疗和有效预防了冠心病，增强预防心脏病的功能[1]，保护和改善机体自身的免疫系统，用于预防和治疗各种疾病以及原因不明的慢性心肌功能衰竭等[2]，具有用于镇痛、镇静、解热和抗癌、促进体内血清氧化酶和蛋白质正常合成的重要作用[3]。美人松松针和松针提取物的成分中含有丰富的皂苷元，是一种三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，即皂苷(saponin)，是美人松松针提取物成分中的重要活性化学成分。美人松具有镇痛抗菌、解热、镇静、抗癌和抵抗恶性肿瘤[4]等有价值的多种生物活性化学功效，具有良好的临床应用和前景[3,5]。

目前国内外对于三萜皂苷的生物提取技术有水煮浸提法、有机溶剂浸提法、超声波提取法、闪式超声波提取法、回流超声波提取法、微声波回流提取法。而相对于有机溶剂浸提法、水煮浸提法、超声波提取法提取的时间过长，闪式提取时间短，但是提取率不高[3]。然而闪式提取的方法在技术上具有天然植物活性成分最大保留、无热敏性损伤、提取的时间短、组织快速、活性成分平衡等特点[1，3，6]。超声波闪式提取法作为一种新型的提取技术,在天然植物热敏性成分的提取中所能够显示独特技术优势，可以广泛用来快速提取天然热敏性植物中的活性成分,具有高效、快速、节能等技术优点,最重要的技术特点是不易直接破坏热敏性提取物的组织结构[6，7]。本文的实验将闪式活性成分提取与天然植物超声波活性成分提取的技术进行紧密结合，极有可能使其达到高效、节能、快速和高提取率的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美人松松针采摘于吉林农业科技学院校园内，置于电热恒温干燥箱80℃常压干燥至恒重，粉碎至80目筛，装入磨口玻璃瓶备用。

实验室的分析纯品试剂：选用人参皂苷rb1标准实验品(多为实验室制或自制)；硫酸、香草酸甲醛、丙酮、高氯酸、石油二甲醚、无水乙醇、乙醚、氯仿等各类生物化学分析试剂以及各类药品均可作为临床实验室的分析纯品。

1.2 实验仪器与器材

yre-2000a旋转蒸发器或re-52a（中国上海亚龙盛华仪器厂）、紫外可见分光光度测量计uv-2800ah（uniko上海仪器有限公司）或v-1100d可见分光光度计（中国上海米波达仪器有限公司）、恒温水浴锅（中国天津市恒温水浴检测仪器有限公司）等、数控超声波清洗机unikq3200db（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线绘制 准确地称取人参皂苷rh1标准品5 mg，用甲醇溶液稀释至 10 ml，浓度为0.5 mg/ml的人参皂苷rh1标准品空白甲醇溶液，分别 称 取 120 μl、280 μl、440 μl、600 μl、760 μl、920 μl，分别摇匀置于具塞试管中。在水浴中加热蒸发甲醇，分别加入0.4 ml 5%的香草醛冰醋酸空白甲醇溶液和1.6 ml的高氯酸，摇匀，塞紧，置60℃水浴中继续加热15 min，取出冷却至室温，分别加入10 ml的冰醋酸[8]。以空白甲醇溶液的吸光度作为对照。在560 nm的可见光波长处进一步测定皂苷吸收光度A[9]。以皂苷rh1的皂苷质量x(mg)与吸收光y(A)为例进行非线性回归，得标准曲线回归方程。根据回归标准曲线得到回归方程，y（oa吸光度数值）=ax（皂苷的质量）+b。最后进一步计算皂苷提取率。

1.3.2 皂苷提取工艺及精制工艺 提取工艺：美人松松针→干燥→粉碎→称取美人松针粉末20 g→适量加入有机溶剂提取剂→闪式提取→再次收集有机溶剂提取液→超声波处理→收集上层清液→抽气过滤→减压→干燥→得粗皂苷→然后用水将粗皂苷溶解→适量加入正丁醇萃取→反复萃取3次→除去水层→再次回收正丁醇→干燥→皂苷提取物。

精制工艺：得粗皂苷→用水溶解→适量正丁醇萃取→萃取3次→除去水层→回收正丁醇→干燥至恒重→测定含量。

美人松松针皂苷得率的测定，根据标准曲线计算松树松针皂苷含量。

式中，m为样品的平均质量（g）；v为提取液的平均分子体积（ml）；x为提取液中样品所含的三萜皂苷的平均浓度（mg/ml）。

1.3.3 皂苷的成分检验检测 氯仿-浓硫酸清液反应联合试验(salkowski联合反应)：试管取上层清液2 ml→清液用高温热水浴再次蒸发后蒸干→蒸干后的试管加入新的氯仿溶解层或者浓硫酸清液溶解1 ml→后转入干燥小管的试管→浓硫酸1 ml→氯仿层或者浓硫酸溶解层显示粉红色或兰花绿色或有淡黄绿色的酸性荧光[10]。

1.3.4 有机提取溶剂的选择 准确称量松枝粉末4份，每份4 g，将4份样品分别放入三角瓶中，分别加入20 ml的乙醇、丙酮、石油醚和蒸馏水进行闪式提取后进行合并有机提取液,再依次进行超声波提取，合并上清液。将有机提取液进行抽滤干燥。根据提取皂苷得率的公式进行有机提取美人松松针皂苷的含量，最终的方法是选择与提取美人松松针皂苷得率含量最高相对应的有机提取皂苷溶剂作为最佳提取工艺的有机提取皂苷溶剂。

1.4 实验设计

1.4.1 单因素实验 本次的研究主要是在单因素的实验中采用了5个关键因素，即闪式提取的温度、闪式提取的时间、超声波提取的功率、超声提取的时间、液料比,闪式提取的温度（℃）从低到高分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。闪式提取的时间（min）分别从高到低为 2 min、3 min、4 min、5 min、6 min。超声波提取的超声功率（w）分别为：40 w、50 w、60 w、70 w、80 w。超声波提取的超声时间（min）分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。液料的处理质量分配比（m∶v）分别为 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；处理的液料一次处理重复3次。

1.4.2 响应面法优化实验设计数据 在单因素中心组合实验的数据基础上，采用了box-behnken（中心单因素组合设计实验）方法分析设计实验中的因素与中心组合水平，利用box-designexpert8.0.6软件进行了设计。最终根据响应式的曲面设计方法来分析确定各相关影响因素之间的直接交互作用及直接影响美人松松针总皂苷含量和提取率的程度，筛选得出了优化美人松松针工艺的关键条件[11，12]。

2 结果与分析

2.1 美人松松针中总皂苷标准曲线的绘制

从计算结果来看，美人松松针中总皂苷与560nm处测定的吸光度线性关系良好，线性关系R2为0.999 8，回归方程为 y=2.849 1 x-0.022 7（见图 1）。

2.2 单因素实验

2.2.1 闪式提取温度对美人松松针中总皂苷提取率的影响 使用闪式乙醇提取法时,温度从50℃逐渐增加到70℃，随着提取液温度的增加，皂苷的活性成分在提取液含量明显上升，温度增加，皂苷的活性成分在提取液中的含量也呈上升的趋势，最大提取温度为70℃，70℃后乙醇提取液中皂苷含量连续明显下降。一方面可能是由于温度过高造成皂苷的热敏感性损耗；另一方面可能是由于提取液的高温、有机溶剂的挥发、乙醇含量明显降低所致。随着提取液温度的进一步升高，提取液的活性成分颜色逐渐变深，温度过高，部分活性成分被有机溶剂破坏，曲线也呈明显下降的趋势，即提取液的总皂苷乙醇含量明显下降（见图2）。

2.2.2 闪式提取时间对美人松松针皂苷提取率的影响 随着提取皂苷时间的缩短和延长,溶液中皂苷的含量逐渐流失和增加，5 min左右溶液中皂苷达到最大提取值，即达到最大提取率，并且溶液中皂苷含量多少会随时间的缩短和延长而逐渐降低。其中的原因可能主要是溶液中的皂苷提取和溶解一般不会随提取时间的延长而增加，相反有机溶剂会在较长的皂苷提取时间内快速挥发，皂苷含量一般也会随时间增加而损失。皂苷提取部分受到光、氧、热的相互作用影响，稳定性会大大降低，部分结构发生变化，从而直接影响皂苷提取率。因此，从各种提取方向的角度上来考虑，使用闪式超声进行提取时，浸提皂苷的时间一般不宜过长（见图3）。

2.2.3 超声波功率对美人松松针皂苷药物提取率的直接影响 超声波提取功率在50～70 w，随着溶液中超声波提取功率的大幅度增加，皂苷的最大提取率开始有明显的增加，在70 w时达到最大提取值，随后稍有小幅度的下降,可能主要是由于溶液中的皂苷在空气中发生了分解，随着溶液温度的升高，90 w又开始有一个小幅度的提高，之后温度即开始呈现大幅度下降的趋势（见图4）。

2.2.4 料液比对美人松松针皂苷提取率的影响 从图5可以清楚地看出,随着料液比的进一步增加，皂苷的提取率逐渐得到增加，当料液比达到1∶30时，皂苷的含量达到最高水平。其原因可能主要是因为当物料与其他液体的比例达到1∶30时，大部分有效成分已被液体溶解。因此，考虑到可以节省物料的溶剂用量和降低物料后续的加工成本等多种综合利用因素，以1∶30为最佳的料液比。具体参见图5（物料的横坐标转换为小数点表示）。

2.2.5 超声波提取时间对皂苷提取率的重要影响如图6所示，提取时间在10～30 min时，提取率明显增加；当提取时间为30 min时，总皂苷总量最大，之后提取率随时间逐渐降低。

2.3 响应面法实验

2.3.1 响应面法实验结果 在单因素的因素水平实验数据基础上，进行4因素3水平实验的响应面方差分析的实验，结果如表1所示，数据的方差分析的结果如表2所示。

2.3.2 响应面数学模型建立及其显著性检验 利用designexpert8.0.6软件进行验证提取率计算结果如表2所示，回归方程：提取率=7.67-0.058 A+0.11B-0.32 C+0.12 D-0.044 AB-0.33 AC-0.41 AD-0.13 BC+0.14 BD-0.05 CD-1.11 A2-0.56 B2-0.60 C2-0.82 D2回归模型提取率p＜0.000 1，结果极其显著；失拟误差项p=0.993 2＞0.05，表明回归失拟相对于纯误差项的影响程度是不显著的，说明回归模型的拟合度和提取率较好，该模型和回归方程的提取率可以广泛地用于分析和预测美人松松针皂苷的拟合度和提取率；根据其f值大小可以准确判断，在所有的自变量对因变量的提取时间影响程度来说，闪失因素的提取时间温度分别为p=0.000 1、微波功率提取温度p=0.007 9＜0.01，极显著，影响的程度最高，影响提取效果一般的为液料对比和超声时间，超声提取时间液料比p值通常＞0.01，液料比p＞0.05；并且它们的二次项分别为 A2、B2、C2、D2、影响之间的对比，p＜0.01，差异极显著；在交互项中的影响之间对比，根据其f值的大小，其交互影响的二次项大小分别为AD＞AC＞BD＞BC＞CD＞AB，各影响因素对美人松松针皂苷提取率的交互影响不是简单线性的关系，图7—图12分别显示了每个因素的影响之间交互作用等高曲线和交互作用响应图。

表1 响应面法实验结果情况

采用designexpert8.0.6软件，设计分析得出美人松松针皂苷的最佳闪式超声预测提取条件：最佳闪式条件提取的温度70℃，液料比1∶30，闪式条件提取的时间5 min，超声波提取的闪式条件：最佳超声预测提取时间30 min，超声预测提取功率70 w,利用软件对松针皂苷的预测提取率为7.9%,在此预测提取条件下的实际模型中所测定提取值为7.85%，相差0.05%，实际模型中所测定的松针皂苷闪式提取率与之前模型中计算的闪式条件预测值间的相对偏差较为微小，可以充分证明实际模型的预测值与实际的结果基本符合。

表2 回归方程的方差分析

3 结论与讨论

本研究先进行单因素影响试验，在此基础上利用响应面法进一步优化了提取工艺的参数，以提取率作为响应值，考察闪式提取的温度、闪式提取的时间、超声波提取功率、液料比、超声辅助提取的时间对于美人松松针皂苷闪式提取率的影响，利用软件对闪式提取数据的拟合分析得出了美人松松针皂苷的提取回归方程，并对其进行方差分析，得出影响美人松松针总温度和皂苷闪式提取率的因素依次为皂苷闪失提取的温度＞皂苷超声辅助提取功率＞皂苷超声辅助提取时间＞液料比＞闪失提取的时间。最佳的提取条件和工艺参数为超声波闪式提取最佳温度70℃，液料比1∶30，闪式提取时间5 min，超声波提取时间30 min，闪式超声波提取功率70 w，利用软件对美人松松针皂苷的有效预测提取率为7.9%，在此有效提取条件下的实际测定提取值为7.85%，相差0.05%，实际提取中所测定的松针皂苷的提取率与之前模型计算的松针皂苷预测值间的相对偏差也是较为微小的，充分证明模型的预测值与实际的结果基本符合。