匹伐他汀对高尿酸血症大鼠血尿酸、炎症因子、血管内皮功能的影响①

尤 杨 戚国庆 高宏阳 杨志瑜 李 柳 赵红亮

(河北医科大学第一医院心内三科，石家庄 050031)

随着生活方式的改变，高尿酸血症的发病率不断升高，高尿酸血症和高血压、高血脂、肥胖、胰岛素抵抗等传统心血管疾病的危险因素关系密切，近来研究发现高尿酸血症也是心血管疾病的独立危险因素，若高尿酸血症未得到有效控制，则增加心血管疾病的发生风险，因此探讨如何防治高尿酸血症具有重要意义。高尿酸血症和其他相关疾病的病理机制复杂，其中炎症反应和血管内皮功能损伤在高尿酸血症引起心血管疾病中发挥重要作用，尿酸进入平滑肌细胞可导致细胞增殖，激活单核细胞趋化蛋白-1(VCAM-1)，导致炎症细胞因子合成增多，造成组织损伤[1]；尿酸合成过程中产生的超氧阴离子可灭活内皮舒张因子一氧化氮(NO)，从而损伤内皮功能[2]。匹伐他汀为第三代他汀类药物，具有较强的降低低密度脂蛋白和胆固醇的作用，在调节血脂、抑制炎症反应和改善内皮功能中发挥重要作用[3-5]。本文对匹伐他汀对高尿酸血症大鼠血尿酸、炎症因子、血管内皮功能的影响进行研究，探讨匹伐他汀是否通过抑制炎症反应和改善内皮功能发挥对高尿酸血症的防治作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康、清洁级、8周龄、体质量190～210 g、SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2009-3。

1.1.2药品与试剂 匹伐他汀(北京双鹳药业公司，批号20180621)，盐酸乙胺丁醇(四川天台山制药公司，批号20181005)，酵母膏(北京奥博星生物技术有限公司，批号20170814)，尿酸、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、NO ELISA试剂盒(美国Sigma公司)，苏木素、伊红染液(国药集团化学试剂有限公司)，SP免疫组化染色试剂盒(美国Invitrogen公司)，兔抗鼠血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)单克隆抗体(美国Santa-Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组 将60只大鼠根据随机数字表法分为对照组(C组)、模型组(M组)、匹伐他汀低剂量组(LP组)、匹伐他汀高剂量组(HP组)，每组15只。

1.2.2建立高尿酸血症大鼠模型 除C组外，其他各组均建立高尿酸血症模型，具体方法为：将盐酸乙胺丁醇12.5 mg/(kg·d)+酵母膏15 g/(kg·d)+适量蒸馏水配制成0.8 ml溶液，1次/d，灌胃，共6周，大鼠2次空腹血尿酸≥420 μmol/L表明高尿酸血症模型建立成功[6]。C组大鼠每d给予等量生理盐水灌胃，共6周。

1.2.3药物干预 在建模的同时，即从建模第1天开始，LP组大鼠和HP组大鼠分别给予低剂量和高剂量匹伐他汀治疗，根据文献[7，8]，LP组大鼠给予0.21 mg/(kg·d)匹伐他汀、HP组大鼠给予0.42 mg/(kg·d)匹伐他汀，将各组匹伐他汀用生理盐水配制成2 ml溶液，灌胃，共6周。C组和M组大鼠给予等量生理盐水灌胃，共6周。

1.2.4标本采集 用药结束后，乙醚麻醉大鼠，摘眼球取血，将血液标本采用高速低温离心(3 000 r/min) 5 min，留取血清进行血清学检查。取血后将大鼠仰卧位固定，沿大鼠左右腋前线剪开胸腔，暴露心脏，注射器抽取甲醛溶液和10%磷酸盐缓冲液2 ml从心尖注入，分离周围组织，充分暴露主动脉弓和胸主动脉，向下钝性分离暴露腹主动脉，截取主动脉2.5 cm，将其放入含10%磷酸盐缓冲液的甲醛溶液中固定，经石蜡包埋，用于HE染色和免疫组化染色。

1.2.5血清学指标检测 血尿酸、TNF-α、IL-6、NO采用ELISA法测定，CRP采用免疫透射比浊法测定，ET-1采用放射免疫法测定。

1.2.6HE染色测定大鼠主动脉病理学变化 将主动脉石蜡切片脱蜡至水，放入苏木素染液中染色7 min，蒸馏水冲洗1 min，盐酸乙醇分色20 s，蒸馏水冲洗1 min，淡氨水返蓝10 s，蒸馏水冲洗，将切片放入伊红染液中染色5 min，蒸馏水冲洗1 min，梯度酒精脱水，透明，封片，显微镜下观察染色情况。

1.2.7免疫组化染色测定主动脉中VCAM-1蛋白表达 将主动脉石蜡切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液进行抗原热修复，蒸馏水冲洗，加入过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，加入一抗(1∶100)过夜孵育，加入二抗孵育2 h，PBS冲洗，DAB显色，苏木液染核5 min，蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水，透明，封片，OLYMPUS BX60显微镜观察染色情况，ImagePlus5.1图像分析软件测定阳性表达区域的积分吸光度，计算平均吸光度(积分吸光度/主动脉横截面积)，以平均吸光度表示VCAM-1在主动脉中的表达强度。

2 结果

2.1各组大鼠血尿酸水平比较 与C组比较，M组、LP组和HP组血尿酸水平升高(P<0.05)；与M组比较，LP组和HP组血尿酸水平降低(P<0.05)，HP组血尿酸降低更为显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血尿酸水平比较Tab.1 Comparison of blood uric acid levels in each group of

2.2各组血清炎症因子水平比较 与C组比较，M组、LP组和HP组血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高(P<0.05)；与M组比较，LP组和HP组血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低(P<0.05)，HP组血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低更为显著(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比较Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-6 and CRP levels in each group of

2.3各组NO、ET-1水平比较 与C组比较，M组、LP组和HP组NO水平降低(P<0.05)，ET-1水平升高(P<0.05)；与M组比较，LP组和HP组NO水平升高(P<0.05)，ET-1水平降低(P<0.05)，其中HP组NO水平升高、ET-1水平降低更为显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠NO、ET-1水平比较Tab.3 Comparison of NO and ET-1 levels in each group of

2.4各组主动脉HE染色比较 C组大鼠主动脉内皮完整，结构正常；M组大鼠主动脉见内皮细胞肿胀，向动脉腔凸起；LP组和HP组大鼠主动脉内皮细胞肿胀明显减轻，其中HP组大鼠主动脉内皮细胞肿胀减轻更为显著。见图1。

图1 各组主动脉HE染色(×400)Fig.1 HE staining of aorta in each group(×400)

2.5各组主动脉中VCAM-1表达比较 C组大鼠主动脉VCAM-1呈阴性；M组大鼠主动脉VCAM-1呈阳性表达；LP组和HP组大鼠主动脉VCAM-1表达较M组降低，其中HP组减弱更显著。见图2。与M组比较，LP组和HP组主动脉VCAM-1平均吸光度值降低(P<0.05)，其中HP组主动脉VCAM-1平均吸光度值降低更为显著(P<0.05)。见表4。

图2 各组主动脉VCAM-1免疫组化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of aortic VCAM-1 in each group(×400)

表4 各组大鼠主动脉VCAM-1平均吸光度值比较Tab.4 Comparison of mean absorbance values of VCAM-1 in aorta of each group of

3 讨论

高尿酸血症可引起体内代谢紊乱，包括糖代谢紊乱、氨基酸代谢紊乱、脂肪代谢紊乱等，高尿酸血症引起的机体代谢紊乱是高尿酸血症发生发展以及肾脏疾病和心脑血管疾病的发病机制。他汀类药物在高胆固醇血症的治疗以及心血管疾病发病的预防中被广泛应用，具有良好效果。他汀类药物对高尿酸血症也有防治作用，如温淼等[9]研究发现阿托伐他汀可降低缺血性卒中患者高尿酸血症发生率。匹伐他汀作为第三代他汀类药物，是否对高尿酸血症也有防治作用？本文对其进行研究，发现高尿酸血症模型大鼠血尿酸水平显著升高，匹伐他汀可显著降低血尿酸水平，高剂量匹伐他汀降低血尿酸水平的效果优于低剂量匹伐他汀组，表明匹伐他汀对高尿酸血症具有防治作用。匹伐他汀降低血尿酸水平的机制尚不清楚，分析可能为：高尿酸血症患者常存在肾脏损伤，匹伐他汀具有保护肾脏的作用，故匹伐他汀可能通过保护肾脏功能降低血尿酸水平。因篇幅有限，本研究未对匹伐他汀降低血尿酸的机制进行探讨，后续将对其进行详细研究。

高尿酸血症和血清炎症因子关系密切，研究发现高尿酸血症患者血清炎症细胞因子水平升高。血尿酸水平升高时，析出尿酸盐结晶，尿酸盐结晶在血管壁沉积，对血管内膜造成损伤，引起血管内膜的慢性炎症损伤，损伤的内膜上黏附大量单核细胞，单核细胞释放TNF-α、IL-6等炎症因子，导致血清中TNF-α、IL-6水平升高；血尿酸水平升高可激活单核细胞NF-κB，单核细胞NF-κB释放TNF-α、IL-6等炎症因子，也导致血清TNF-α、IL-6等炎症因子水平升高；尿酸盐本身也是白细胞释放TNF-α、IL-6等炎症因子的使动因素[10，11]。CRP为急性相性蛋白，在巨噬细胞和中性粒细胞激活时在TNF-α、IL-6等炎症因子刺激下，由肝细胞合成，故高尿酸血症也可引起血清CRP水平升高[12]。血清炎症因子水平的升高可引起血管内膜增厚，引起动脉硬化斑块形成，从而导致心脑血管并发症的发生。匹伐他汀具有抑制炎症反应的作用，如Iqbal等[13]研究发现匹伐他汀通过抑制炎症反应减轻心肌损伤；Mao等[14]研究发现匹伐他汀通过抑制单核细胞介导的炎症反应抑制急性心肌梗死后左心室重构；Nakagomi等[15]研究发现匹伐他汀可抑制血脂异常患者体内的炎症反应。本文对匹伐他汀对高尿酸血症的炎症反应的影响进行研究，发现高尿酸血症大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高，匹伐他汀可显著降低高尿酸血症大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平。表明匹伐他汀对高尿酸血症患者体内的炎症反应具有抑制作用，匹伐他汀通过抑制高尿酸血症的炎症反应改善血管功能，从而降低心脑血管疾病的发生。

血管内皮损伤后体内一些物质浓度发生变化，这些可反映细胞内皮损伤和内皮功能的物质称为内皮损伤标志物。NO和ET为常用的内皮损伤标志物。NO为主要的血管舒张因子，可引起血管平滑肌松弛，导致血管扩张；NO进入血液后可抑制血小板聚集，对抗血小板激活，具有防止血栓形成的作用，NO同时具有增加血管致密性的作用[16]。ET为作用最强的缩血管活性多肽，具有促进血管平滑肌细胞增殖的作用，正常情况下，血清ET水平极低，血管内皮细胞损伤后ET大量释放，促进血管平滑肌细胞增生，导致动脉粥样硬化斑块的形成[17]。高尿酸血症可引起血管内皮损伤；血尿酸水平升高可引起NO水平降低，ET水平升高，促进动脉粥样硬化形成，在冠心病、高血压等心血管疾病的发生发展中具有重要作用；高尿酸时析出的尿酸盐结晶在血管壁沉积，损伤血管内膜，促进血小板黏附聚集，造成血栓形成；血尿酸盐结晶也可导致炎症的发生，从而促进动脉粥样硬化的发生。血管内皮损伤时可释放VCAM-1等细胞分子，VCAM-1为内皮细胞活化和损伤的标志物，正常情况下动脉内皮VCAM-1几乎没有表达，内皮细胞活化或损伤的情况下，VCAM-1表达量显著增加[18]。匹伐他汀具有改善血管内皮功能的作用，如赵子粼等[19]研究发现匹伐他汀可改善急性冠脉综合征血管内皮功能；Zhao等[20]研究发现匹伐他汀钙可改善高胆固醇血症患者的内皮功能，延缓其动脉粥样硬化的进展；詹小娜等[21]研究发现匹伐他汀具有改善中青年高脂血症合并颈动脉斑块患者血管内皮功能的作用。本文对匹伐他汀对高尿酸血症大鼠内皮功能进行研究，发现高尿酸血症大鼠血清NO水平降低，ET-1水平升高，主动脉中VCAM-1表达量增加；匹伐他汀可升高高尿酸血症大鼠血清NO水平，降低ET-1水平，降低主动脉中VCAM-1表达量，表明匹伐他汀可改善高尿酸血症大鼠血管内皮功能，从而防止动脉粥样硬化斑块发生，降低心脑血管疾病发生率。

综上所述，匹伐他汀干预可降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，抑制炎症反应，改善血管内皮功能。