小分子化合物小檗碱靶向CDK2抑制C6神经胶质瘤细胞生长的分子机制研究*

马徐民，罗斌华，胡美纯，王 华**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院基础医学院基础医学研究中心)

神经胶质瘤是高发病率、高死亡率的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，是一类严重危害人类健康的疾病之一[1]。由于恶性程度高、诸多药物无法透过血脑屏障等特点，目前对神经胶质瘤的治疗方法十分有限。并且，胶质瘤对放化疗等治疗手段的耐受性较强，导致治疗效果差，且治疗后易复发，患者中位生存期较短[2]，因此，寻求一类有效的治疗药物已迫在眉睫。与传统药物相比，小分子具有副作用小、特异性高且能够透过血脑屏障等优势，是目前神经胶质瘤药物治疗的研究热点[3]。小檗碱(berberine)是从黄连植物的根茎中提取出的一种小分子活性物质，又称作黄连素，是一种异喹啉生物碱，临床上作为一类降糖中药用于糖尿病的治疗；它对细菌性肠炎、恶性肿瘤也有较好的效果[4-6]；对乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌等诸多恶性肿瘤都有明显抗肿瘤活性[7-9]，作用机制可能与p53、Bcl-2蛋白介导的信号通路有关。但是，小檗碱在神经胶质瘤中的作用机制却鲜有报道。CDK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是真核生物中细胞分裂周期的重要调控因子。体内CDK2水平的增高被认为与肿瘤患者预后差相关，这导致肿瘤细胞增殖不可控[10]。目前CDK2是肿瘤药物筛选的潜在靶点，基于CDK2靶点筛选到的小分子以及多肽药物已经进入到临床试验中。通过分子对接发现，小檗碱能和CDK2的ATP结合区域结合。而且小檗碱能够抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移以及克隆形成，下调肿瘤细胞CDK2水平。本文通过计算机模拟与实验相结合，研究深入分子机制层面，为小檗碱治疗神经胶质瘤的临床药理作用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞：鼠源脑神经胶质瘤细胞C6由罗斌华教授馈赠。主要试剂：小檗碱购自Solarbio公司，青链霉素、两性霉素购自北京索莱宝科技有限公司，MTT试剂购自碧云天生物公司，过硫酸铵(APS)、十二烷基磺酸钠(SDS)购自Sigma公司，胰蛋白酶、Loading buffer(5X)、ECL发光试剂盒、DMSO、MTT试剂、预染蛋白Marker购于碧云天生物公司，脱脂奶粉购于美国BD公司、PVDF膜购于美国Millipore公司，甘油、甲醇购于武汉中天化工公司，抗体均购于ABclonal。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测小檗碱对C6细胞增殖的抑制作用

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL细胞悬液，铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充。5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物，细胞贴壁后即加药，前一天下午铺板，次日上午加药，5%CO2，37℃孵育72h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液后每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值间接反映活细胞数目，以小檗碱浓度0μmol/L为对照组，其他所有实验均按此原则进行。细胞存活率=(实验组OD-对照组OD)/(对照组OD)，设定对照组存活率为1。实验组存活率与之相比，若存活率小于1则药物对细胞有抑制增殖作用；若大于1，药物对细胞有促进增殖作用，实验重复3次后将数据整理利用Graphpad prism软件进行作图分析。

1.2.2 细胞划痕实验测试药物对C6细胞迁移的抑制作用

先用marker笔在6孔板背面用直尺划线，每孔4条横线，每孔加入5×105个细胞待贴壁。待细胞密度达到100%时用黄色移液器枪头平行于背面的marker印迹划横线，用无菌PBS缓冲液清洗细胞3遍。分别加入不同浓度(0、1、5、10、25、50μmol/L)小檗碱，设阴性对照组。当对照组细胞迁移满后，实验停止，4%多聚甲醛固定细胞后拍照。Image J软件进行数据测量和计算，细胞迁移率=(0h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0h划痕宽度×100%，实验重复3次后将数据整理利用Graphpad prism软件进行作图分析。

1.2.3 平板克隆实验检验小檗碱对C6细胞克隆形成的抑制作用

将细胞状态较好并处在对数生长期的C6细胞，胰酶消化1～2min，1000rpm离心弃上清液，细胞计数。每孔2000个细胞接种于六孔板中，隔天给药后置于CO2培养箱中培养7d左右。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，用PBS清洗细胞2次。加4%多聚甲醛固定液5mL固定细胞15min，去固定液，加适量结晶紫染色液染10～30min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率，Image J软件计数并作图分析，克隆形成率(对照组)=实验组克隆数/对照组克隆数×100%。实验重复3次后将数据整理利用Graphpad prism软件进行作图分析。

1.2.4 免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测小檗碱作用后CDK2的表达水平

小檗碱处理C6细胞后，对细胞裂解提取总蛋白。具体方法：去除培养基，用PBS涮洗，每皿加入50μL细胞裂解液(其中含有Cocktail、PMSF、NaVO3)，并使培养皿倾斜放入冰中10min使细胞裂解充分，将细胞裂解液转移至灭菌的1.5mL EP管中，使用冷冻高速离心机在4°C的条件下离心(12000rpm，10min)后将沉淀弃掉，上清液即为细胞总蛋白。利用BCA法测蛋白浓度，一抗4°C过夜，二抗常温孵育1h，自动发光凝胶成像系统读取结果，实验重复3次后分析结果。

1.2.5 小檗碱与CDK2计算机模拟

本文采用Autodock Tool[11]进行计算机模拟。受体分子CDK2蛋白质是从PDB数据库中下载得到(PDB ID：2EXM)，剔除原有结构中的配体和水分子。配体分子小檗碱由Chem Bio Office绘制并转换成pdb文件；受体分子经过加氢加电荷等处理后，设定Gridbox，进行格点计算得到格点文件；最后，将小檗碱与受体分子进行分子对接，得到10个不同的分子构象。通过文献中其他小分子抑制剂比对以及10个分子构象结合自由能参数分析，最终确定分子对接的最佳构象。

1.3 统计学方法

本研究采用Graphpad prism软件进行数据处理并绘图，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05可说明结果具有统计学差异。

2 结 果

2.1 小檗碱抑制C6神经胶质瘤细胞的增殖及克隆形式

与对照组相比，小檗碱能够明显抑制C6神经胶质瘤细胞的增殖能力(图1～2，封三)。随着小檗碱浓度的升高，C6细胞的增殖活力明显下降(图1A，封三)，当小檗碱浓度达到5μmol/L时，肿瘤细胞间隙增加，部分细胞出现皱缩，细胞存活率下降约25%。而在浓度为25μmol/L时，细胞存活率仅为50%。当浓度达到最大给药浓度50μmol/L时，细胞存活率下降了75%左右(图1B，封三)，这说明小檗碱对C6肿瘤细胞具有明显的杀伤效果。

在克隆形成实验中，不同浓度小檗碱处理C6细胞72h后，肿瘤细胞克隆形成率随药物浓度的升高也呈下降趋势(图2A，封三)。当浓度为5μmol/L时，细胞克隆形成率仅为50%。而当浓度为50μmol/L时，其克隆形成率为10%以下(图2B，封三)。因此，小檗碱能够有效抑制C6神经胶质瘤细胞的迁移及克隆形成能力。

2.2 小檗碱能够抑制神经胶质瘤细胞的迁移能力

细胞伤口愈合实验所示如图3A(封三)所示，当药物处理48h后，对照组细胞已迁移满，实验停止，固定细胞后进行拍照。和对照组相比，在相同给药时间下，C6细胞的迁移能力随着药物浓度的增高呈下降趋势。在给药12h，当小檗碱浓度为25μmol/L时，C6细胞的迁移能力降低约40%，在浓度为50μmol/L时，迁移能力可以降低80%以上(图3B，封三)。因此，小檗碱能够显著抑制C6神经胶质瘤细胞的迁移能力。

2.3 小檗碱下调C6胶质瘤细胞CDK2蛋白表达水平

不同浓度的小檗碱处理C6胶质瘤细胞72h后，利用Western Blot技术检测CDK2蛋白的表达，CDK2蛋白随着小檗碱浓度的增高而下降(图4A)。对Western Blot条带结果所进行灰度值统计分析发现，药物浓度为10μmol/L时，CDK2的蛋白已下降50%以上(图4B)。因此，小檗碱可下调C6细胞CDK2蛋白的表达。

A.不同浓度小檗碱可下调CDK2蛋白表达水平；B.Western Blot结果灰度值统计结果(n=3，与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.4 小檗碱结合于CDK2的ATP结合区域

通过计算模拟发现，小檗碱与CDK2的ATP结合区域结合(图5B)。结合文献以及分子构象结合自由能最低原则，在分子对接得到的10个构象中，第8个构象是最优构象，其结合自由能为-7.71(表1)。CDK2中的疏水氨基酸Leu134、Phe80、Phe82、Val18和Ile10形成的疏水口袋将berbine锚定在ATP结合口袋中。并且，CDK2的极性氨基酸Asp145和Lys33侧链能够与小檗碱的甲氧基中的氧氢键结合，而His84与小檗碱喹嗪环中的两个O具有氢键相互作用(图5C)。并且，与其他CDK2小分子抑制剂的三级结构比对发现，小檗碱的空间构象与其他小分子类似，均是通过Leu134、Phe80、Phe82、Val18以及Ile10形成的疏水作用以及Asp145和Lys33形成的氢键作用进行结合(图5D)。因此，疏水作用和氢键相互作用在berbine与CDK2的结合中起着重要作用。通过计算机模拟，可以为小檗碱靶向CDK2抑制神经胶质瘤生长提供理论依据。

A.CDK2蛋白晶体结构，其N端具有ATP结合区域(PDB ID：2EXM)；B.小檗碱与CDK2的ATP区域结合；C.小檗碱位于Leu134、Ile10、Phe80和Phe82形成的疏水口袋中，并与Asp145、Lys33以及His84具有氢键结合作用；D.小檗碱与其他CDK2小分子抑制剂的分子构象比对(PDB ID：1PYE，2DUV，2EXM，2VV9，3MY5)

表1 小檗碱与CDK2分子对接的分子构象结合自由能及RMSD值

3 讨 论

与传统药物相比，小分子靶向药物对其所针对的肿瘤具有较为突出的疗效，并且有耐受性好、毒性反应较轻、可通过血脑屏障等优势[12]。小檗碱作为一种异喹啉生物碱，在自然界分布广，有着良好的开发优势。肿瘤是由环境、遗传、营养和饮食等多种不同因素相互作用引起的一类严重疾病，传统临床上针对神经胶质瘤的治疗多采用手术切除并辅助放化疗，但是由于放化疗对正常细胞同时具有杀伤作用，副作用较大，通常治疗后常并发严重不良反应。目前在临床上已经广泛使用的小分子靶向药物，例如伊马替尼、吉非替尼分别在慢性粒细胞白血病(CML)急变期与转移性非小细胞肺癌都已取得显著效果[13]。分子靶向性药物的研究必定会有力的推动神经胶质瘤在临床上的治疗进程。

C6是一株高度恶性的鼠源神经胶质瘤细胞，常用作胶质瘤研究的细胞模型。CDK2蛋白的异常高表达与肿瘤细胞的发生发展密切相关，尤其在细胞周期信号通路中是起着关键作用的蛋白之一，以CDK2蛋白为靶点设计抗肿瘤药物已经成为药物的研究与开发的重要方向。本文分子对接结果显示，小檗碱能够与CDK2的ATP结合区域结合，并且，实验证实小檗碱对C6神经胶质瘤细胞的增殖、迁移与克隆形成均具有抑制作用；Western Blot结果显示，小檗碱通过下调CDK2对神经胶质瘤起抑制作用。结合小檗碱分子对接结果，我们推测，小檗碱很有可能是靶向CDK2，通过竞争性抑制ATP的结合，从而抑制神经胶质瘤生长。然而，这些分子机制需要进一步深入研究。

总而言之，本研究把计算机模拟与实验研究相结合，在细胞层面证实小檗碱对神经胶质瘤起抑制作用，并研究小檗碱对肿瘤细胞中CDK2蛋白表达的影响，这为小檗碱对神经胶质瘤的治疗提供了理论依据，为小分子药物小檗碱成为抗肿瘤靶向性药物奠定了基础。