基于质粒分子的转crylAa基因棉花定量PCR方法的建立

摘要：[目的]转crylAa基因棉花南农6号为我国未经批准商业化种植的棉花品种。为监测其非法种植，解决阳性标准品不容易获得的问题，构建适合转cylAa基因棉花南农6号品系特异性检测的质粒分子pMD-NN6，以该质粒分子作为标准物质，建立相应的实时荧光定量PCR方法。[方法]根据南农6号转化体特异序列和棉花内标准基因acpl设计引物，采用重叠PCR方法构建质粒分子;以质粒分子作为标准物质，南农6号转化体特异序列为靶标，建立了南农6号棉花特异性定量检测方法。[结果]构建的质粒全长为3148bp，含有南农6号品系特异性序列和棉花acpl基因序列两个靶标片段的质粒分子，定量标准曲线斜率和扩增效率均符合要求，定量检测限为30拷贝。两个已知南农6号含量的混合样品（2.0%和0.5%）定量检测的准确度标准偏差均在土25%范围内，精确度相对标准差均S25%。[结论]建立的PCR定量检测方法可以用于含有南农6号转基因棉花产品的品系特异性定量检测，所构建的标准质粒pMD-NN6可以代替其基因组DNA作为标准物质使用。

关键词：抗虫棉;质粒分子;acpl基因;crylAa基因;品系特异性实时PCR

中图分类号：S562

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（2020）06-0569-07

0引言

[研究意义]棉花是我国大面积商业化种植的转基因作物。2017年最新统计数据表明，我国转基因棉花种植面积为290万hm，达到了棉花种植总面积的95%以上。目前我国批准种植的棉花品种仅2018年就达到了330多个品种，包括美国孟山都公司的MON531和中国农业科学院生物技术研究所的国抗系列GK12和sGK321等。另外，MON15985、LLcotton25、抗虫棉花COT102、GHB614、MON1445、MON88913等品系被允许进口用作加工原料。转基因抗虫棉外源基因类型以crylAc基因和crylAb/Ac融合基因为主，还有一部分CpTItcrylA基因，品种多、来源广（http：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/index1.htm）。转crylAa基因棉花南农6号（F代，下同）为一种未经批准商业化种植的棉花品种，国外也尚未见商业化种植的报道，但是在我国的棉花种植中被检测到”。因此，开发快速的特异性检测方去，用来监测转crylAa基因棉花南农6号的非法种植是非常必要的。[前人研究进展]目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。实时荧光定量PCR技术以其特异性强、重复性好、灵敏度高和高通量等优点成为PCR技术的首选。其检测的靶标包括转基因元件、构建特异性序列、基因特异性序列和转化体（品系）特异性序列。其中，品系特异性检测的特异性最强。转基因棉花MON531、MON757、GK12、MON15985和MON88913等的品系特异性实时荧光定量PCR方法均有报道"7。我国对转基因植物及其成分虽然实施没有阈值的标识制度，但制定实施了一系列标准，包括主要转基因成分的检测标准如35S启动子、tnos终止子、Bt基因、gus基因、CpTI基因等。转基因抗虫棉花Lcotton25、MON88913、MON1445等的定性PCR检测标准陆续建立起来一叫，并建立了专门针对crnylAa基因表达盒特异性检测方法”。王叶等对转crylAa基因棉花南农6号F1的整合结构进行了解析，获得213bp的5'旁侧序列，并以基因组DNA为标准品，建立了实时荧光定量PCR方法叫。[本研究切人点]植物基因组DNA是转基因实时荧光定量检测常用的标准品，但是不容易大量获得、纯度也较低，长期放置稳定性差。近几年，质粒分子因为稳定性好、成本低、纯度高、容易获得的优势，在转基因检测领域逐渐发展成为广受欢迎的一种基因组DNA替代品吗。作为定性检测的阳性对照和定量标准物质，质粒DNA更适合对多个靶标基因同时检测明。基于质粒分子作为标准物质的转crylAa基因棉花南农6号的定量方法尚未见报道。[拟解决的关键问题]本研究构建含有crylAa基因棉花南农6号品系特异性序列和棉花acpl内标准基因两个靶标的质粒分子，以该质粒分子作为标准品，建立适合南农6号品系特异性定量检测的实时荧光定量PCR方法，有效解决了阳性基因组DNA标准品不容易获得的问题，实现对南农6号品系非法种植的有效监测。

1材料与方法

1.1材料准备和DNA提取

抗虫棉南农6号（江苏神农大丰种业科技有限公司，国审2005016）种子由当地种子市场购买。其他棉花样品均由中国农业科学院植物保护研究所转基因植物环境安全监督检验测试中心提供，采用植物基因组提取试剂盒提取单粒棉花基因组DNA。

1.2引物和探针

引物和探针的详细信息如表1所示。质粒构建引物、特异性引物和定量引物根据南农6号转化体特异序列（登录号HQ233648）设计。棉花acpl基因作为内标准基因，根据国家标准设计则。本研究所有引物和探针均采用Primer2.0软件（AppliedBiosystems，FosterCity，CA）设计。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。探针由上海英俊生物技术公司合成，5'端和3'端分别标记FAM荧光基团和BHQl猝灭基团。

1.3重组质粒分子的制备

采用重叠PCR方法使用两对引物acpl-F/R和acp-mn6/nn6-QR，以南农6号基因组DNA为模板，分别扩增并连接南农6号品系特异性片段和棉花acpl內标准基因片段。获得的重组片段转化大肠杆菌JM110感受态细胞，进行克隆、测序。

1.4质粒DNA提取和稀释

经测序验证序列正确的重组质粒菌液于37C摇培至对数生长期，提取质粒DNA，分别用分光光度计和0.8%凝胶电泳检测其完整性并测定浓度。

用超纯水将质粒DNA稀释为3X10～3X10'拷贝的7个系列浓度梯度（相当于每每应分别加入3X10'～3X10'拷贝质粒DNA），用于建立标准曲线和定量方法的评价。标准曲线建立，每个浓度梯度重复测3次，每次3个平行;定量方法评价，每个浓度重复测3次，每次4个平行。

1.5两个南农6号混合样品的制备

使用南农6号单粒种子和非转基因棉花单粒种子制备2.0%和0.5%两个不同质量百分比含量的混合样品。提取DNA作为模板用于定量方法对实际混合样品的检测，验证准确度和精确度。每个样品DNA重复测3次，每次3个平行。

1.6PCR条件

常规PCR、重叠PCR、定量PCR反应体系和程序均参照文献[14]的方法。

2结果与分析

2.1质粒分子构建

使用重叠PCR方法成功构建了含有209bp的南农6号品系特异性序列和210bp的acpl内标准基因序列两个靶标片段的质粒分子pMD-NN6，为闭合环

状双链DNA，全长3148bp，其结构图和序列详细信息见图1。

2.2引物特异性

目前我国市场商业化种植的抗虫棉外源基因包括crylAc基因和crylAb/Ac基因2种，转cryAa基因棉花未允许在我国商业化种植，包括南农6号。因此本研究选用非转基因棉花、9个代表性转基因棉花品种作为阴性对照。其中，皖棉13、中棉35、冀668、中棉所48、中棉所41、鲁棉研15为国内转crylAc基因和crylAb/Ac基因代表性抗虫棉品种;MON531和MON757为孟山都公司的两个代表性转crylAc基因棉花品种，在我国均具有不同程度的市场份额;MON1445为抗除草剂棉花品种。使用特异性引物对南农6号及上述转基因棉花、非转基因棉花进行PCR扩增，结果（图2）表明：仅南农6号获得了预期201bp扩增，其他转基因和非转基因棉花均为陰性。可见，该引物能够特异性区分出南农6号与其他抗虫棉品系。

2.3标准曲线的建立

为验证构建的质粒分子pMD-NN6作为标准物质用于南农6号品系准确定量的适用性，以3X10～3X10'拷贝的7个浓度梯度的质粒DNA作为模板，分别建立了基于南农6号棉花品系特异性序列和棉花acpl内标准基因序列为靶标的两个标准曲线。标准曲线和扩增图如图3所示。品系特异性序列3次重复的PCR扩增效率（E）分别为0.991、0.985和0.994，相关系数（r）分别为0.999、0.999和0.999，均接近于l;acpl内标准基因序列3次重复的扩增效率分别为1.057、1.051和1.041，相关系数（r）分别为0.996、0.998和0.999，也接近于1。以上结果表明，两个定量反应具有理想的扩增效率，模板起始拷贝数和Ct值之间具有良好的线性关系（表2），建立的两个标准曲线可以用于南农6号准确定量。

2.4定量方法的可重复性和检测限

应用建立的定量方法对3X10^～3X10'拷贝的6个浓度梯度的质粒DNA分子进行了定量检测，3次重复性检测结果的可重复性标准差（SD）在0.02～0.24，相对标准差（RSD）在0.07%～0.75%，均具有较好的可重复性，表明应用该方法可以准确定量到30个拷贝（表3）。上述结果表明，该方法适合对南农6号的身份鉴定和准确定量，定量方法的检测限（LOQ）为30个拷贝。

2.5定量方法的准确性和精确性

为进一步验证定量方法的准确性和精确性，考虑到国际标识管理的需要，对2.0%和0.5%两个已知南农6号含量的混合样品进行了定量检测。校正系数Cfs（Calibrationfactors，品系序列拷贝数lacpl内标准基因拷贝数）用以校正质粒DNA和植物基因组DNA在PCR效率等方面存在的差异而导致定量结果存在的偏差。Cfs值的确定以南农6号基因组DNA.作为模板，测定结果平均Gfs值为0.95（表4）。由公式：样品转基因含量=外源目的基因的拷贝数/内标准基因的拷贝数X100%XCfs计算出两个混合样品中外源DNA的含量如表5所示，2.0%含量的平均定量检测值是1.96%，0.5%含量的平均定量检测值是0.45%。实际测定值和真实值之间的准确度标准偏差（bias）分别为-2.03%和-9.17%，精确度标准差（SD）分别为0.07和0.04，相对标准差（RSD）分别为3.44%和9.04%，均低于土25%可接受值。根据定量PCR反应的校正系数（Cfs）可知，南农6号基因组DNA中品系特异性序列和acpl内标准基因的拷贝数之比为0.95，接近1，因此测定的2.0%和0.5%两个不同转基因含量和质量百分比含量是一致的。实际上，国际标识管理规定的是转基因含量检测范围为5.0%～0.9%。因此，0.5%含量可以满足转基因定量检测的要求，表明质粒分子pMD-NN6可以代替基因组DNA作为定量标准品，建立快速、准确的南农6号实时荧光定量PCR方法，以便实时监测南农6号棉花的非法种植。

3讨论

在转基因检测领域，作为定性检测的阳性对照和定量标准品，质粒DNA分子替代基因组DNA应用越来越普遍。特别是通过人工插入多个靶标序列，从而实现对高通量检测，广泛应用于水稻、玉米、棉花、大豆等作物的转基因检测。与基因组DNA作为标准品相比，质粒分子纯度高，具有更低的检测限41618本研究建立的定量方法用于转crylAa基因棉花南农6号可以检测到30拷贝，和杨阳等.H报道的基因组DNA作为标准品检测限44个拷贝相比，具有更高的检测灵敏度。

标准物质作为一类具有严格赋值的用于对其他物质进行定量，或对检测方法进行评价的物质，其计量的标准化对于转基因检测的准确性、可靠性和有效性至关重要。目前，真正能够溯源的有证标准物质并不多，质粒分子有证标准物质更是仅限于转基因玉米MON810、NK603、98140等几种转化体。作为全球广泛种植的转基因棉花，目前尚无可用于检测的质粒分子有证标准物质，因此质粒分子标准物质的研制是非常必要的。本研究构建的质粒分子pMD-NN6建立的定量方法均满足国际相关标准的要求，如定量标准曲线的扩增效率（E）和相关系数（r）接近1，混合样品定量准确度标准偏差（bias）、精确度标准差（SD）和相对标准差（RSD）均《25%。本研究结果一方面可以对转crylAa基因棉花南农.6号进行特异性检测和准确定量，以便实时监测其非法种植;另一方面可以为转基因棉花质粒分子标准物质的研制提供参考数据。

另外，南农6号基因组DNA中品系特异性序列和acpl内标准基因的拷贝数之比为1：1，已知acpl内标准基因在棉花基因组中的拷贝数为2拷贝，据此推测南农6号品系特异性序列在棉花基因组DNA中应为2个拷贝，这一结果也进一步验证了利用质粒分子可以用来确定外源基因拷贝数的应用么，但还需要通过其他的，如sourthern杂交等方法进行确证。

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（責任编辑：杨小萍）

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