高效液相色谱法测定特殊医学用途婴幼儿配方食品中乳铁蛋白含量

朱丹丹　洪辉　吴红宇　吴芝岳　辛正杰

摘 要：本研究以食品安全国家标准《食品中乳铁蛋白的测定（征求意见稿）》为参考，优化预处理步骤和梯度洗脱条件，建立了一种用紫外高效液相色谱测定特殊用途婴幼儿配方食品中乳铁蛋白含量的方法。色谱柱为C4，5 μm，300A，250 mm×4.6 mm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%三氟乙酸，检测波长为280 nm。结果表明，乳铁蛋白的检出限为2.3 mg/100 g，定量限为3.9 mg/100 g，在乳铁蛋白浓度为10～140 μg·mL-1范围内，检测结果呈良好线性关系，回收率在98%～105%。用此方法检测婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量，操作简单，结果准确可靠，精密度高，重现性好。

关键词：乳铁蛋白;高效液相色谱法;特殊医学用途婴幼儿配方食品;紫外检测器

Abstract：This study was based on the national food safety standards food on the determination of lactoferrin， optimizing the pretreatment steps and gradient elution conditions， establishing a method with a HPLC to determin the lactoferrin containingin infant special medical purposes formula food Chromatographic conditions： the chromatographic column was C4， 5 μm， 300A， 250 mm×4.6 mm， the mobile phase A was acetonitrile， the mobile phase B was 0.1% trifluoroacetic acid， and the detection wavelength was 280 nm. The results showed that the detection limit of lactoferrin was 2.5 mg/100 g， and the determination limit was 4.0 mg/100 g which is in the range of lactoferrin concentration of 10～140μg·mL-1. The detection results showed a good linear relationship， and the recovery rate was 98%～105%. The method on determining lactoferrin content in infant formula has more convenient operation， higher precision， higher accuracy and better repeatability.

Key words：Lactoferrin; HPLC; Formula foods for infants and young children for special medical purposes; Ultraviolet detector

中图分类号：O657.72

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

特殊医学用途婴幼儿配方食品，市场购买;乳铁蛋白标准品（纯度≥95%），购自北京美正检测技术有限公司;乙腈（CH3CN，色谱纯，含量≥99.8%），购自美国天地试剂公司;磷酸氢二钠（Na2HPO4，含量≥99.0%）、磷酸二氢钠（NaH2PO4，含量≥99.0%）、氯化钠（NaCl，含量≥99.5%）、氯化钾（KCl，含量≥99.5%），购自国药集团化学试剂有限公司;盐酸（HCl，含量≥99.5%），购自浙江三鹰化学试剂有限公司;三氟乙酸（CF3CO2H，含量≥99.0%），购自上海麦克林生化科技有限公司。

1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司生产;MS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司生产;pH计（精度为0.01），瑞士梅特勒-托利多公司生产;TGL-16M冷冻离心机，盐城市安信实验仪器有限公司生产;XW-80A涡旋混合器，上海医大仪器有限公司生产;C4色谱柱，沃特世科技（上海）有限公司生产;乳铁蛋白肝素免疫亲和柱，北京美正检测技术有限公司生产;0.22 μm微孔滤膜，天津市津腾实验设备有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 实验原理

样品中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，肝素亲和柱净化后，利用C4色谱柱分离，于280 nm波长处紫外检测器检测，外标法定量。

1.2.2 试剂配制

（1）磷酸盐缓冲溶液。称取8.00 g氯化钠、2.92 g

十二水磷酸氢二钠、0.20 g磷酸二氢钾、0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解后，用盐酸调节pH至7.4，再加水至1 000 mL。

（2）結合缓冲液。称取30.083 g十二水合磷酸氢二钠，2.496 g二水合磷酸二氢钠，加入20 mL试剂A（50×浓缩液），加入900 mL水溶解，最后定容至1 000 mL。试剂A为升级后此款肝素亲和柱配套使用溶液，升级后产品测得回收率更高。

（3）洗脱液。称取7.52 g十二水合磷酸氢二钠、0.624 g二水合磷酸二氢钠、29.2 g氯化钠，加入400 mL水溶解，最后定容至500 mL。

（4）0.1%三氟乙酸溶液。取三氟乙酸1.00 mL，用水定容至1 000 mL，摇匀，过0.22 μm滤膜，超声后备用。

如果磷酸氢二钠和磷酸二氢钠均为无水，需要进行折算。

1.2.3 样品处理

（1）提取。称取3 g（精确至0.01 g）样本于50 mL螺口塑料离心管中，先加入约30 mL结合缓冲液涡旋振荡至样本充分溶解，再加入结合缓冲液定容至刻度，混匀。于4 ℃，9 800 r·min-1转速条件下离心20 min，离心后轻轻取出中间层，上层有脂质，下面有沉淀，用大量程的移液器将中间液体部分吸出，注意不要吸取上层脂质和下面沉淀。取其中的10～15 mL作为上样液。

（2）净化。取出肝素亲和柱，注射器针筒直接穿透柱塞，连接肝素亲和柱，去掉亲和柱下方堵头，加压排出柱内的保存液，待柱内保存液与筛板齐平后，取5 mL结合缓冲液平衡亲和柱。

（3）上样。待结合缓冲液液面接近筛板后取净化步骤处理完毕后样品提取液15 mL过柱（若样本量大可分次加入，用SPE流速调节阀控制上样流速，约0.3 mL·min-1），弃去全部流出液。

（4）淋洗。待样品提取液加完，液面与筛板齐平后，加10 mL结合缓冲液，进行亲和柱的洗杂。

（5）洗脱。进行洗杂后，排干柱内结合缓冲液，向肝素亲和柱内加入4 mL洗脱缓冲液，靠重力流速滴出，流速≤1滴/s，收集全部洗脱液，并定容至4 mL，将收集液过0.22 μm滤膜，进样。

1.2.4 标准曲线的制作

乳铁蛋白标准储备液（10 000 μg·mL-1）：在已购买的10 mg乳铁蛋白标准品小瓶中准确加入1.00 mL磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀1 min。该标准溶液在-20 ℃下可保存6个月。

乳铁蛋白标准工作液（1 000 μg·mL-1）：准确吸取标准储备液50 μL于进样小瓶中，再准确加入450 μL结合液涡旋混匀。该标准工作液在0～4 ℃冰箱中可保存2周。

乳铁蛋白标准工作溶液的配制：分别准确吸取标准工作液10、30、50、70 μL和140 μL于5个进样小瓶中，再分别加入990、970、950、930 μL和860 μL洗脱缓冲液，涡旋混匀，得到10～140 μg·mL-1系列浓度标准液。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做曲线回归方程。

乳铁蛋白含量计算：

（1）

式（1）中，W-乳铁蛋白含量，单位为mg/100 g;ρ-样液检测浓度，单位为μg·mL-1;4-洗脱体积，单位为mL;V-定容体积，单位为mL;15-上样体积，单位为mL;m-样品称样量，单位为g;1 000-浓度单位换算系数;n-稀释倍数。

1.2.5 高效液相色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry300tm C4 5μm，4.6×250 mm

Column;柱温30 ℃;进样体积30 μL;流速

1.0 mL·min-1;检测波长280 nm;流动相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈。流动相梯度洗脱程序如表1所示。

2 结果与分析

2.1 乳铁蛋白的标准工作曲线及標准品

将浓度为10、30、50、70 μg·mL-1和140 μg·mL-1工作液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作曲线回归方程。结果表明，标准曲线为y=1.878 1x-14.337 4，

线性相关系数R2=0.999 0，线性关系良好。标准曲线图谱见图1，标准品图谱见图2，样品图谱见图3。

2.2 检出限和定量限

依据药典2010版第二部附录XIX A《药品质量标准分析方法验证指导原则》，认为信噪比为3∶1时相应浓度为方法检出限，信噪比为10∶1相应浓度为方法定量限。从曲线最低点开始分别稀释至1、3、5、7 μg·mL-1和9 μg·mL-15个浓度，分别得到信噪比约为0.86、3.35、9.08、14.49和21.49，故认为本方法的检出限为3 μg·mL-1，定量限为5 μg·mL-1。用公式

（1）换算得到相应乳铁蛋白含量，

（2）

式（2）中：X-试样中乳铁蛋白的含量，单位mg/100 g;C-待测液中乳铁蛋白的浓度，单位μg·mL-1;3.5-洗脱液体积;V-定容体积;15-上样液体积;m-称样量，单位g。计算检出限时称样量以3 g计，定容体积为100 mL。

故本研究中乳铁蛋白检出限为2.3 mg/100 g，定量限为3.9 mg/100 g。

2.3 方法回收率

根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》

（GB/T 27404-2008）的要求，结合实际检测样品中的乳铁蛋白含量以及亲和柱的柱容量，对样品进行3水平的加标测定，同时做空白实验。回收率在98%～105%，表明本方法准确度较高。加标回收结果见表2。

2.4 方法精密度

利用特殊医学用途婴幼儿配方食品同一天进行同一样品进行6个平行试验，RSD结果1.61%，小于10%，表明本方法的精密度较好，测定见表3。

2.5 方法重现性

对同一批特殊医学用途婴幼儿配方食品分别进行6次独立测定，RSD结果小于10%，表明本方法的重现性较好。测定结果见表4。

3 结论

本方法采用肝素免疫亲和柱净化，C4色谱柱分离，外标法定量。初步建立了一种准确、高效的特殊医学用途婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的含量测定方法，结果表明：在10～140 μg·mL-1浓度范围内，标准曲线具有良好的线性关系，方法的检出限为2.3 mg/100 g，定量限为3.9 mg/100 g，平均回收率为102%，同一天同一样品检测结果RSD为1.61%，耐受性实验中检测结果的RSD为3.58%。各数据均符合相应国家标准，且结果良好，能满足目前大部分市面上婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量测定。