剪切波弹性成像定量评估微波消融活体兔肝热损伤的实验研究

朱惠娟，朱才义

1.湖南省妇幼保健院超声科，湖南 长沙 410008；2.深圳市宝安区妇幼保健院，广东 深圳 518000

中国癌症新增病例增长迅速，其中肝癌新发病例占全世界范围内新发病例的54%，如何从根本上提高肝癌患者生存率、缓解病痛是目前亟待解决的问题[1]。微波消融以其更好的穿透性和更加适形的消融形状广泛运用于肝癌的微创治疗中[2]，精准评价消融完全与否对于保证消融安全和提高疗效意义非常重大[3]。最近有研究表明，弹性成像在微波消融的监测与评估上具有实用的价值与广阔的前景[4-6]。本实验对热损伤灶不同区域内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)黄递酶进行定性以及半定量评估，对比研究消融灶不同硬度区的杨氏模量值与消融灶组织学、细胞酶学的变化，希望利用剪切波弹性成像(shear wave elastography，SWE)定量反映组织热损伤程度，以探讨杨氏模量定量评价微波消融组织病理改变的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料 30只新西兰大白兔，6～10个月龄，体质量2.5～3.0 kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供(动物质量合格证号SCXK＜湘>2014-0011)，对动物的处置符合动物伦理学要求[伦理编号：2015(科研伦审)-024]。氯化硝基蓝四唑盐(NBT，Sigma公司，美国)、氧化型辅酶Ⅰ(NAD，Sigma公司，美国)、吩嗪硫酸甲酯(PMS，Sigma 公司，美国)、4%乳酸钠20 mL(中衫金桥生物公司)、麻醉剂：1%戊巴比妥钠溶液(江莱生物科技公司)。

1.2 主要仪器及手术器械 EC0-100C型组织间实体瘤超声引导微波凝固治疗仪(南京亿高公司)、Aixplorer 超声波诊断仪(SuperSonic Imagine 公司)、SCI5-4 线阵探头(频率为4～15 MHZ，法国SuperSonic Imagine)、肝脏手术器械包(自备)。

1.3 手术方法 1%戊巴比妥钠(1 mg/kg)麻醉。在无菌操作下于剑突下腹部正中作“人”字形切口，充分暴露肝脏，将18G 消融针穿过肋间隙，在超声引导下穿过左外叶进入左内叶最厚处。由于兔肝较薄，消融容易损伤周围组织，通过反复预实验，统一设置微波治疗仪的参数为：输出功率40 W，消融时间1 min。准备就绪后，按预定的消融参数，进行消融。

1.4 SWE 检查流程 消融结束即刻行二维超声检查，找到消融灶的最大切面，稳定超声探头同时运行SWETM 程序。SWE 检查采用双幅模式，SWETM取样框包括全部病灶范围及周围肝实质，当5～6 帧弹性成像稳定后，SWE根据组织硬度的不同转换成彩色图谱。当颜色呈现匀和稳定的状态，且整个颜色区域至少包含2/3 取样框时，切面前方无手法过重引起颜色误判，后方无噪声干扰时，弹性图变化基本一致时，认为检查成功。运行SWE 测量程序(Q-BOXTM)，统一弹性值圈设置直径为1 mm，将弹性值圈放在感兴趣区(region of interest，ROI)，包括消融区、消融周围区、未消融区，记录三个区域的平均杨氏模量值(SWE mean)，以kPa 表示，每个区域任意选取5个位置测量，取平均值。所有测量均为同一个医生操作完成，每次测量必须保证超声切面的一致性。

1.5 标本取材及处理方法 注射过量麻醉剂处死实验兔，取消融灶组织并保留周围正常组织5 mm作为检测标本，迅速切除消融灶组织，将标本保证在同一个超声切面下切开，将完整的标本放在液氮中速冻，行OCT 包埋后做冰冻切片，行NADH 黄递酶组织化学染色法，每个标本抽取平整无折叠4张冰冻切片。

1.6 NADH 黄递酶组织化学染色法 孵育液由硝基蓝四唑盐(NBT) 100 mg、氧化型辅酶I (NAD+)50 mg、磷酸盐缓冲液80 mL、吩嗪硫酸甲酯(PMS)10 mg、4%乳酸钠溶液20 mL 组成。统一将切片整齐放入孵育盒中，浸泡30 min，用双蒸水冲洗切片10 min，晾干后用甘油明胶封片剂进行封片。阴性对照实验：将以上孵育液不加入乳酸钠，其他成分不变，按上述方法进行染色作为对照。

1.7 NADH 黄递酶染色原理 细胞质内含有大量乳酸脱氢酶，代表了细胞的活力，它可以将底物乳酸钠催化形成丙酮酸，同时将H+传递给NAD+，生成的NADH可以与硝基蓝四唑盐反应生成蓝紫色颗粒，沉淀于胞浆内。消融灶内细胞由于微波热损伤而失活，线粒体内的酶被破坏，故胞浆不染色。

1.8 酶组织化学染色定量分析 将NADH 黄递酶组织化学染色的冰冻切片放在400 倍视野下观察，每张切片随意选取10 个视野，利用图像分析软件Image-Plus 6.0 定量测量切片中NADH 黄递酶在消融区、消融周围区、正常未消融区表达的颗粒数量、累积光密度值(integrated optical density，IOD)，取平均值。

1.9 统计学方法 应用SPSS22.0 软件包对数据进行统计学分析，计量资料符合非正态分布规律，以中位数M (P25，P75)表示，组间差异性比较采用Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消融后消融灶弹性变化图及肉眼观图分布情况 弹性成图根据消融后组织硬度的差异进行彩色编码，形成以电极为中心3个类圆形区域，即消融区(红色区图1A)：SWE 显示红色区域，杨氏模量值为高值；消融周围区(黄色区图1B)：SWE显示黄绿色区域，杨氏模量值介于高值与正常值之间；未消融区(蓝色区图1C)：蓝色区域，杨氏模量值为低值。肉眼观下，消融即刻兔肝组织可分为消融区、消融周围区和未消融区，见图2。

图1 兔肝组织即刻消融后的弹性成图

图2 兔肝组织消融后不同区域肉眼观

2.2 弹性图与消融即刻兔肝组织病理学变化 弹性成图根据消融后组织硬度的差异进行彩色编码，形成以电极为中心3个类圆形区域(图3)。消融区：在弹性图变化上为红色区域A，杨氏模量值为94.95 kPa，NADH 黄递酶染色上未见蓝染颗粒或极少数蓝染颗粒，记为-或±；消融周围区B：弹性图变化上为黄绿色区域，杨氏模量值为37.85 kPa，NADH黄递酶染色显示散在、稀疏的蓝染颗粒，记为++；未消融区C：弹性图变化上为蓝色区域，杨氏模量值为10.30 kPa，NADH黄递酶染色显示细胞质内可见密集、大片蓝染颗粒，证明该区域内酶有活性，细胞功能正常，记为+++。

2.3 消融区、消融周围区和未消融区内NADH黄递酶表达的颗粒数量、IOD 及杨氏模量值比较 经Kruskal-Wallis 检验，结果显示：颗粒数量、IOD、杨氏模量值在消融区、消融周围区、正常未消融区三者之间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。表明，消融后的肝脏组织，其酶的颗粒数量、IOD、杨氏模量值在各区域存在差异性，相对于正常组织，在消融区低表达，在消融周围区介于两者之间；微波消融后组织明显变硬，越靠近消融区组织硬度增大，杨氏模量值增高，越靠近正常未消融区硬度变软，对应的杨氏模量值降低，见表1。

2.4 杨氏模量值与NADH 黄递酶表达的颗粒数量、IOD的相关性 杨氏模量值与NADH黄递酶表达的颗粒数量呈负相关(r=0.703，P＜0.001)；杨氏模量值与NADH 黄递酶表达的IOD 呈负相关(r=0.657，P＜0.001)，见图4和图5。

图3 NADH黄递酶组织化学染色(NADH×400)

表1 消融灶三个区域内NADH黄递酶表达的颗粒数量、IOD以及杨氏模量值比较[M(P25，P75)]

图4 杨氏模量值与颗粒数量的散点图(r=-0.703，P＜0.001)

图5 杨氏模量值与IOD的散点图(r=-0.657，P＜0.001)

3 讨论

微波消融成为治疗肝脏恶性肿瘤的重要手段之一，这种高效率的手术方法已获得了与外科手术旗鼓相当的远期疗效，更新了微创手术记录[7]。精准评价消融效果对于保证消融安全和提高疗效意义重大，最近研究表明，弹性成像在微波消融的监测与评估上具有实用的价值与广阔的前景。WIGGERMANN等[8]认为超声弹性技术可以初步反映肝脏凝固灶的范围；彭金波等[9]分析了弹性成像技术对射频消融灶边界显示清晰，有望成为评价射频消融灶的有效方法；本实验的前期研究也表明，弹性成像在评价消融灶范围的可行性。

本研究中运用超高速剪切波弹性成像定量评估组织硬度的技术特点，探讨它对即刻消融灶热损伤进行定量评估的可行性。肝组织经过有效热场的作用发生蛋白质变性，无疑使硬度明显增加，弹性成图根据消融后组织硬度的差异进行彩色编码，以电极为中心形成3 个类圆形区域：消融区(A)，SWE 显示红色区域；消融周围区(B)，SWE 显示黄绿色区域，正常未消融区(C)，SWE显示蓝色区域，同时观察与测量三个区域内的杨氏模量值分布情况，结果显示各组差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，并且杨氏模量值以电极为中心形成规律性地递减，因此说明SWE 可以初步反映消融即刻组织硬度的分布情况，这与国内、外研究一致。SUGIMOTO 等[5]对大鼠的肝脏进行微波消融，并用3D的SWE来进行评估，发现消融灶中心、消融边界、未消融区的杨氏模量值分别为(59.1±21.9) kPa、(43.1±1.5)kPa、(10.3±0.8)kPa，说明杨氏模量值与热损伤的程度存在一定的相关性；其次在消融边界的研究上，MARIANI等[10]通过对长白山猪肝的射频消融灶进行弹性评估，将消融边界的细胞进行HE染色，预测猪肝组织凝固性坏死与否的弹性阈值为20 kPa。这说明SWE 的优势不仅可以提高常规超声对消融范围的辨别能力，还能够对组织的热损伤程度提供一定的参考依据，因此，定量评估组织硬度对来判断消融疗效具有一定的前景，也给未来弹性成像在微波消融的监测过程提供了新的研究方向。

本研究试图从细胞学角度，探讨杨氏模量值与定量评估消融热损伤的可行性。本实验选取NADH黄递酶组织化学染色来衡量细胞在即刻消融后功能上的变化，研究发现消融区在弹性图变化上为红色区域，杨氏模量值显示最高的区域，NADH黄递酶染色上未见蓝染颗粒或极少数蓝染颗粒，记为-或±；消融周围区在弹性图变化上为黄绿色区域，杨氏模量值介于高值与正常值之间，NADH黄递酶染色显示散在、稀疏的蓝染颗粒，记为++；未消融区在弹性图变化上为蓝色区域，杨氏模量值为低值的区域，肝小叶结构完整，肝窦稍扩张，细胞质内可见密集、大片蓝染颗粒，记为+++。

与HE 染色相比，NADH 黄递酶组织化学染色在评价即刻消融效果上更敏感。由于消融即刻可能对细胞具有一定的热固定作用，短时间内细胞不会发生改变，因此，从细胞形态学角度出发，HE 染色难以判断消融即刻细胞坏死的程度，利用酶组织化学染色可以检测消融边界的细胞活性[11-13]。本实验中发现消融周围区细胞呈散在阳性，相对于正常区域内的酶活性强度明显减弱，细胞损伤程度较消融中心轻微，并且对NADH黄递酶表达的颗粒数量、IOD在三个区域内分布情况进行定量分析，发现各组差异具有统计学意义(P＜0.05)，定量分析可以更加直观、具体地反映消融即刻组织的损伤程度与细胞活性改变。

通过Image-Plus 6.0图像分析软件对消融区、消融周围区、正常未消融区内NADH黄递酶表达的的颗粒数量、累积光密度值作定量分析，最后利用杨氏模量值与NADH黄递酶表达的颗粒数量、IOD之间作相关分析，发现杨氏模量值与蓝染的颗粒数量存在负相关，杨氏模量值与IOD存在负相关。消融区组织损伤程度高，导致线粒体内酶的活性越低，杨氏模量值反而越高，越靠近正常区域坏死程度越小，细胞内酶活性越高，杨氏模量值越小。超高速剪切波弹性成像可通过测量杨氏模量值初步定量评估微波消融的热损伤程度。

超高速剪切波弹性成像用于微波消融的监测还属于初步研究阶段，本实验是超高速剪切波弹性成像在定量评估即刻消融组织热损伤程度上的初探，利用杨氏模量的物理特性，探讨消融即刻杨氏模量值与消融即刻细胞活性改变之间的相关性。SWE 的优势是能够对组织热损伤程度提供一定的参考数据，其可通过测量杨氏模量值初步定量评估微波消融的热损伤，给未来弹性成像在微波消融的监测过程提供新的研究方向。