基于荧光数据计算蛋白质-配体结合常数的方程的对比及应用研究

张 静，高 煊, 2，金 亮，王鸿辉，周细平

1. 河口生态安全与环境健康福建省高校重点实验室，厦门大学嘉庚学院环境科学与工程学院，福建 漳州 363105 2. 厦门大学环境与生态学院，福建 厦门 361102

引 言

蛋白质作为重要的功能性生物大分子，在生物体的物质转运、代谢转化、催化作用、信息传递和免疫反应等生命活动中扮演重要角色[1]。而这些生命活动的发生大多涉及蛋白质-配体的结合作用。因此，蛋白质与配体结合作用的研究一直以来都是化学、药学、医学、毒理学以及生物学等多种学科领域的热点问题。

在研究蛋白质和配体结合作用时，评价其结合作用的强弱具有重要意义。以药物分子与生物体转运蛋白质的结合作用为例，其结合作用的强弱直接影响药物在生物体内的药代动力学和药效学特性[2]。评价蛋白质和配体结合作用强弱的重要参数是结合常数(Kb)。目前，多种分析方法可用以获得蛋白质-配体的Kb值，如光谱分析法 (荧光、紫外-可见吸收、圆二色、核磁共振和表面等离子体共振光谱法等)及非光谱分析法如平衡透析法、亲和层析法、电化学方法、等温滴定量热法和分子对接法等[3]。其中，荧光光谱法因其灵敏度高、方便快速及成本低的优点，被广泛用于蛋白质和配体结合作用研究中。

利用荧光光谱法获得蛋白质和配体的结合常数，往往是通过测定配体对蛋白质的荧光猝灭效应，并借助分析方程对荧光猝灭数据进行数学分析来得到Kb值。在该过程中，因不同函数方程的适用范围不同，在使用时应据具体情况进行选择。而以往大量的研究常忽视了这一问题，一些方程被不加选择地使用，使得不同研究者对相同目标物的研究结果相异甚至大相径庭[4]。那么，这其中必定有一些结果是存在问题的。然而，目前很少有研究透彻地对比分析不同函数方程的立脚点、适用范围及其存在的缺陷，来帮助研究人员方便快速地选择合适且有效的分析方程以避免错误的数据分析。

鉴于此，本文拟对现有且常用的用于计算蛋白质和配体结合常数的函数方程进行对比分析。一方面，通过不同方程的推导过程来明确其使用前提和适用范围。另一方面，选取人血清白蛋白质(human serum albumin，HSA)-诺氟沙星(norfloxacin，NFX)结合反应体系作为模型，在方程的实际应用中考察选择不适用的方程对所获结果的影响。此外，我们还对比了不同分析方法获得的HSA-NFX结合反应的Kb值，来评估荧光光谱法计算Kb值的可靠性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

NFX(纯度>98%)和HSA(纯度>96%)均购自美国Sigma-Aldrich公司。配制0.05 mol·L-1pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，并用其作溶剂，分别配制5.0×10-5mol·L-1的HSA储备液及4.0×10-4mol·L-1的NFX储备液，均置于4 ℃冰箱保存。其余试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水(18.2 MΩ·cm)。

F-4600型荧光分光光度计(日立高新技术公司，日本)；UV-8000S紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 HSA-NFX反应体系的配制

荧光猝灭实验体系：向一系列10 mL比色管中加入一定量HSA和NFX储备液，并用PBS缓冲液定容至10 mL，使其中HSA浓度为5.0×10-6mol·L-1，NFX浓度分别为(0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0，150.0，200.0，250.0，300.0)×10-6mol·L-1。设置3组平行样。

Job’s plot 实验体系：样品中固定HSA和NFX总浓度为2.0×10-5mol·L-1，设置HSA的浓度分别为(0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，14.0，15.0，16.0，17.0，18.0，19.0，20.0)×10-6mol·L-1，NFX的浓度随之变化。设置相应的对照组，对照组溶液中仅含与样品组浓度相同的HSA，而无NFX。设置3组平行样。

1.2.2 荧光光谱测定

298 K下，使用 1 cm×1 cm 石英比色皿，设置激发波长为282.0 nm，检测HSA-NFX反应体系在290～480 nm 范围内的荧光发射光谱，扫描速度为1 200 nm·min-1，激发、发射狭缝均为5 nm。所得荧光强度数据均利用公式S1进行内滤效应校正[4]。

1.2.3 吸收光谱测定

于298 K温度下，扫描试液在190～450 nm范围内的紫外-可见吸收光谱，所得数据用于HSA-NFX反应体系的荧光内滤效应校正。

2 结果与讨论

2.1 荧光静态猝灭数据分析方法的对比

荧光猝灭分为动态猝灭或静态猝灭，其分别由猝灭剂与荧光团的激发态相互作用或猝灭剂抑制荧光团激发态的形成所产生[5]。区分静、动态猝灭最有效的方法是测定荧光团的寿命变化。本文所讨论的计算Kb值的不同方法仅针对因荧光团和猝灭剂间形成基态复合物所引起的静态猝灭过程。因此，据荧光寿命分析判定猝灭方式为静态猝灭后才可参考本文选择合适的计算方法。

基于蛋白质-配体的复合物模型，并将蛋白质-配体的结合划分为1∶1和1∶n(n≥2)结合两类，在支持信息S2部分详细讨论分析了利用荧光光谱数据计算蛋白质和配体结合的Kb值的不同函数方程的推导过程及相应的适用条件。由讨论可知，判断假设a蛋白质-配体复合物不再产生荧光，和假设b添加的配体浓度远大于蛋白质浓度(超过10倍)是否成立是选取适用的函数方程的前提条件。为此，我们总结了蛋白质-配体1∶1和1∶n结合时在不同情形下可选择的分析方程，详见表1。

2.2 不同数据分析方法在HSA-NFX荧光猝灭体系中的应用

在选取上述方程计算HSA与NFX的结合常数前，需首先确定HSA与NFX的结合比。由图1(a)可知，经Job’s plot[6]拟合，两条拟合线的交点处NFX的摩尔分数XNFX≈0.5，表明HSA与NFX结合的化学计量数比为1∶1。在此基础上，进一步研究了不同浓度NFX对HSA的荧光猝灭情况[见图1(b)]。由图1(b)可知，当NFX的浓度大于1.0×10-4mol·L-1时，HSA的荧光即基本被完全猝灭。由此判定，在HSA-NFX体系中，S2.1所提出的假设a成立，即HSA-NFX复合物不再产生荧光。

为讨论需要，选取图1(b)中NFX浓度为0至2.0×10-5mol·L-1时的数据点进行后续分析。在此条件下，S2.1中所提出的假设b是不成立的。此时，方程(S12)是计算HSA与NFX结合常数的最优选择，经非线性拟合得到HSA与NFX的Kb值为5.0×104L·mol-1。如计算时未考虑假设b是否成立而选取方程(S6)，则经拟合得到的Kb值为6.44×104L·mol-1，比使用方程(S12)得到的值大28.8%。

在以往较多的研究中，方程(S17)也常用以计算蛋白质-配体1∶1结合时的Kb值(即默认n=1)[7]。为对比，利用方程(S17)进行拟合分析得到Kb值为4.48×106L·mol-1，这比由方程(S12)所得值高2个数量级。这是由于：(1)方程(S17)的使用前提为假设a和b均成立，而对于本文分析的HSA-NFX体系，假设a成立而假设b并不成立；(2)利用方程(S17)拟合时，利用拟合曲线的截距计算Kb值时涉及10的次方运算，因此拟合过程中斜率n的微小变化就可引起Kb值较大的改变。在针对HSA与保泰松结合常数的研究中，利用方程(S17)拟合得到的Kb值比由最优方程或其他分析方法获得的值约低2个数量级[4]，这也展现了方程(S17)的缺陷对所得结果产生的较大影响，佐证了上述判断。此外，同样默认n为1，利用方程(S24)拟合得到HSA-NFX体系的Kb值为7.43×104L·mol-1，该值比使用方程(S12)得到的值大48.6%。虽如此，利用方程(S24)计算Kb值的可靠性仍强于方程(S17)。

表1 蛋白质-配体1∶1和1∶n结合时方程的选择Table 1 Selection of equations for 1∶1 or 1∶n protein-ligand binding processes

图1 (a)总浓度([HSA]+[NFX])为2.0×10-5 mol·L-1时HSA-NFX体系荧光猝灭的Job’s Plot; (b)不同浓度NFX存在下HSA的相对荧光强度激发波长=282 nm，发射波长=332 nm

Ex=282.0 nm, Em=332.0 nm

综上，在分析假设a成立的HSA-NFX荧光猝灭体系时，如直接选用基于假设b成立的方程，得到的Kb值将会存在一定的误差；同时，应用方程时一些等价的数学变化可能会引入较大的误差，使所得结果明显不可靠。这提示，在应用上述方程计算Kb值时，应按照其使用条件正确选择。然而，令人担忧的是，数据分析时不加选择地使用上述方程的现象仍较为普遍。因此，一些文章中报道的Kb值很可能不能真实反映蛋白质-配体间的真实亲和力。

以往研究者在研究HSA与NFX的结合作用时，除了荧光光谱法，还利用表面等离子共振法、等温滴定量热法和亲和毛细管电泳法来获得Kb值。于此，我们对比了不同分析方法所获得的结果(表2)。由表2可知，不同分析方法所得的HSA与NFX的Kb值主要集中在104L·mol-1这一量级。在这些分析方法中，等温滴定量热法通常被认为是量化结合亲和力的最准确的方法之一，由其获得的Kb值也在这一量级。文献[5]利用荧光光谱法获得Kb值，其数值远远大于其他研究的结果(约高3个数量级)。这是由于该文所设置的HSA和NFX浓度并不符合假设b，却直接使用方程(S17)来拟合数据，放大了误差，其所得结果的准确性值得斟酌。此外，本文所得的Kb值(5.0×104L·mol-1)与等温滴定量热法所得结果[(3.49～3.85)×104L·mol-1]存在一定的差异，这是由于两种方法所检测的结合反应过程中的表观数据不同。荧光光谱法检测的是HSA与NFX结合过程中HSA的荧光强度的变化，而除了与NFX的结合，还有其他不可控的因素(如NFX引起的HSA构象变化)也会影响HSA的荧光强度。因此，利用荧光光谱法所获得的Kb值与真实值仍存在一定的差异。而等温滴定量热法检测的是HSA与NFX结合过程中体系的热量变化，在理想条件下影响实验的因素是可控制的，因此其所得结果更为接近真实值。尽管如此，因荧光光谱法具有简便快速、灵敏度高和成本低的优点，且还能获得蛋白质微观层面的信息，故在蛋白质-配体结合作用的研究中仍值得运用。当然，综合利用多种分析方法来获得和验证蛋白质-配体结合的Kb值可获得更为可靠的结果，值得推荐。

表2 不同分析方法所获得的HSA-NFX体系的结合常数Table 2 The binding constant of HSA-NFX system obtained by different analytical techniques

3 结 论

利用荧光光谱法计算蛋白质-配体结合的Kb值时，判定假设a和b是否成立是选取用于数据处理的最优的函数方程的必要前提。如利用函数方程处理时忽略这一前提条件而选取了不适用的方程，将使计算出的Kb值偏离真实值，从而得到不可靠甚至明显错误的结果。然而，在已有的利用荧光光谱法计算蛋白质和配体的Kb值的研究中，不加选择地应用函数方程的问题仍广泛存在。因此，我们希望本文能有助于提高研究者对这一问题的认识，从而在今后的工作中能避免因忽视该问题而获得不可靠的数据。