微量液体培养基最低抑菌浓度法与罗氏比例法在结核分枝杆菌药敏试验中的价值比较

刘金娜

(辽宁省辽阳市卫生健康服务中心 临床检验科, 辽宁 辽阳, 111000)

近年来，中国结核病防治工作取得了明显进展，但仍任重道远[1-2]。耐药结核分枝杆菌的出现及广泛传播，使得结核病的治疗与控制难度增大[3]。研究[4-5]显示，目前全球结核病情控制的最大障碍之一为耐药结核菌，该结核菌传染期长，痰菌转阴速度慢，诊治过程较为复杂，治疗费用高，且用药后不良反应较多。药敏试验可更好地评估结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性，为临床制定合理有效的结核病治疗方案提供参考依据[6-7]。异烟肼、利福平等是一线的抗结核类药物，快速检测结核分枝杆菌对此类药物的敏感性尤为重要, WHO推荐使用的罗氏比例法稳定性较好，但检测时间较长，需要4周才能报告结果，无法及时为结核病患者的临床用药提供有效的参考意见[8-9]。因此，寻找一种灵敏度高、检测快速的结核分枝杆菌药敏试验方法，对于结核病的临床治疗非常重要。本研究比较了微量液体培养基最低抑菌浓度(MIC)法和罗氏比例法在结核分枝杆菌药敏试验中的应用价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究以100株结核分枝杆菌菌株(由辽宁省结核实验室提供)作为研究样本，研究时间为2018年3月—2019年6月，分别采用罗氏比例法与微量液体培养基MIC法检测结核分枝杆菌的药物敏感性。

1.2 方法

罗氏比例法: 使用接种环将新鲜的菌落提取后，置于磨菌瓶中，与麦氏比浊管进行比浊，制作成1 mg/mL的菌悬液，再经过100倍稀释，得到10-2mg/mL菌液，之后再稀释为10-4mg/mL, 获取2种浓度的工作菌液，分别在2种工作菌液中接种(使用22SWG标准接种环)至含药培养基的斜面。各种抗结核药物在培养基中的浓度见表1。

微量液体培养基MIC法: 将罗氏培养基培养3～4周的结核分枝杆菌挑取出来，用含5%吐温80的生理盐水将其溶解、稀释，再与标准的麦氏比浊管进行对比，制成1 mg/mL的菌悬液，再吸取制备好的混悬液0.2 mL, 将其添加于1瓶培养液中，充分摇匀后作为工作菌液; 用无菌吸管吸取工作液至各个孔板中，各0.5 mL。将瓶盖盖好，并将药敏板置于自封袋中，在37 ℃环境中孵育, 6 d后观察质控孔，如果出现白色颗粒沉淀，在孔中添加25 μL显色剂B、12 μL显色剂A，在37 ℃环境中孵育1～2 d。各种抗结核药物在药敏板中的浓度情况见表1。

表1 各种抗结核药物在培养基或药敏板中的浓度 μg/mL

1.3 观察指标

采用微量液体培养基MIC法和罗氏比例法检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇、二卡那霉素、异烟肼、利福平、氧氟沙星、卷曲霉素的敏感性，比较2种方法的检测结果。罗氏比例法结果判定[10-11]: 在36 ℃环境孵育4周后，若耐药性检测结果超过1%, 则为耐药，若高稀释度空白对照培养基的菌落数低于20个，则应该重复试验; 微量液体培养基MIC法结果判定: 在36 ℃孵育6 d后，将显色剂加入其中，继续培养1～2 d后，若质控孔显示红色，则将其他药敏孔与质控孔进行对比，若为蓝色则表示敏感，若为红色则为耐药，若质控孔显示蓝色，而药敏孔显示红色，则需要重复试验。

1.4 统计学分析

本研究将微量液体培养基MIC法与罗氏比例法应用于结核分枝杆菌药敏试验中, 2种检测方法结果的一致性判断采用Kappa检验。Kappa值超过0.75，表示2种检测方法一致性良好;Kappa值为0.40～0.75，表示2种检测方法一致性一般;Kappa值低于0.40，表示2种检测方法一致性欠佳。

2 结 果

2.1 2种方法的结核分枝杆菌药敏试验结果比较

微量液体培养基MIC法与罗氏比例法检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇、二卡那霉素、利福平、异烟肼、氧氟沙星、卷曲霉素药物的敏感性比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表2。

表2 2种方法检测结核分枝杆菌对不同药物的敏感性结果比较[n(%)]

2.2 2种检测方法的一致性判断

将罗氏比例法作为“金标准”，评估微量液体培养基MIC法的诊断效能。微量液体培养基MIC法在乙胺西醇、二卡那霉素、利福平、异烟肼、氧氟沙星、卷曲霉素药敏试验中的敏感度与特异度较高，与罗氏比例法具有良好的一致性。见表3。

表3 微量液体培养基MIC法的诊断效能

3 讨 论

随着抗结核药物的大量使用，结核耐药菌株在临床出现并播散，耐药结核病已经逐渐成为结核病防治工作中的重点及难点[12-13]。相关研究[14]显示，目前全球结核感染情况严重，约1/3的人感染了结核菌，且发展中国家每年新发800万～1 000万患者。在中国，每年约有15万人死于结核病，其中青壮年人群占比高，若不能有效地控制、治疗该疾病，结核病患者数将继续增加[15]。准确、快速的结核菌药敏试验，能够高效地对广泛耐药结核病进行筛查，而广泛耐药结核病的确定有利于避免耐药性进一步加重，也为结核疾病的治疗提供了理论依据。

在中国，绝对浓度法被视为常规的结核分枝杆菌药敏试验方法且仍在沿用，但该方法对混悬液制备、接种量的要求非常严格，操作者对试验结果有着较大影响，且此法未对“耐药”“敏感”进行明确定义[16]。罗氏比例法的出现在结核分枝杆菌药敏试验中起到了较好的效用，该方法可对药物敏感性试验中的接种量进行校正，并在2种菌液浓度中提取菌群，提升了准确性。液体培养基MIC指药物能够抑制微生物生长的最低浓度，该指标可用来评价药物的杀菌或抑菌作用，检测数值越小，意味着药物效用越强。

本研究采用微量液体培养基MIC法与罗氏比例法对常用抗结核药物进行结核分枝杆菌药敏试验，结果显示，2种方法检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇、二卡那霉素、利福平、异烟肼、氧氟沙星、卷曲霉素药物的敏感性比较，差异无统计学意义(P>0.05), 且2种检测方法的一致性良好，在结核分枝杆菌药敏试验中有着重要的临床应用价值。由此提示，微量液体培养基MIC法也可作为结核分枝杆菌药敏试验的有效方法，且价格更低廉，检验速度更快。王慧等[17]研究指出，采用微量液体培养基MIC法与罗氏比例法对结核菌株进行乙胺丁醇、利福平、卷曲霉素药敏试验发现，2种检查方法的一致性较高，且微量液体培养基MIC法快速、廉价，具有经济适用性，与本研究结论相似。

MIC是实验室中重要的参考指标，可以确认抗微生物的抗菌剂，也可以检测新的抗菌剂的活性，临床治疗感染性疾病时，医生常会根据MIC来选择抗生素并确认抗生素用量; 在微生物学中, MIC为抗菌的最低浓度，可以对过夜培养后的微生物生长速度加以抑制，以保证培养的准确度。罗氏比例法的检测周期较长，多数在4周后才能得到药敏结果，且操作复杂，对实验室人员的要求较高，不利于快速建立药敏检测系统，此外培养基价格昂贵，不利于推广应用。微量液体培养基MIC法的操作相对简单，检测周期短, 7 d即可得到药敏结果，可缩短患者的等待时间，且检测结果很准确，能够作为耐多药结核病的筛查方法。

综上所述，微量液体培养基MIC法应用于结核分枝杆菌药敏试验中与罗氏比例法有着良好的一致性，且检验速度快，经济适用性好，能够为临床指导结核病用药提供参考。