双光子成像在中医药领域的应用

林思思　阿列克谢·沃瑞克哈特斯基　唐勇

摘要 双光子显微镜作为现代最重要的光学显微镜技术，具有3D成像、在体成像、光漂白和光毒性低等特点。该技术已被运用到与中医药相关的细胞成像、组织成像和在体成像研究中，为中医药治疗相关疾病提供更科学和直观的理论依据。本文对现有的双光子显微镜技术在中医药领域的应用研究进行概述，以期为中医药研究提供新方向。

關键词 双光子显微镜;中医药;细胞成像;组织成像;在体成像

Application of Two-photon Microscopy in the Field of Traditional Chinese Medicine

LIN Sisi1，Alexei Verkhratsky1，2，TANG Yong1，3

（1 College of Acupuncture and Tuina，Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China; 2 The University of Manchester，Manchester M139PL，United Kingdom; 3 Key Laboratory of Sichuan Province for Acupuncture and Chronobiology，Chengdu 610075，China）

Abstract Two-photon microscope，as the most important optical microscope technology，showed remarkable advantages of 3D imaging，in vivo imaging，photobleaching and low phototoxicity.It has been utilized in cell imaging，tissue imaging and in vivo imaging related to traditional Chinese medicine （TCM） to provide a more scientific and intuitive theoretical basis for the treatment of related diseases by TCM.This paper summarizes the application research of the existing two-photon microscope technology in the field of TCM，in the hope of providing new directions for the research of TCM.

Keywords Two-photon microscope; Traditional Chinese medicine; Cell imaging; Tissue imaging; In-vivo imaging

中图分类号：R2-03文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.002

双光子显微镜是现代重要的光学显微镜，具有3D成像、活体动物成像、检测灵敏度高、空间定位性高、光漂白和光损伤低等特点，在生物学、神经科学等领域中广泛运用。中医药是我国历史悠久且具有独特理论及技术方法的医学体系，在治疗临床疾病中发挥着不可或缺的作用。中医药领域已经开展了大量中医药临床与基础研究，来阐述中医药治疗的作用及机制。目前最大的问题是创新性和准确性不足，因此结合现代科学技术是推动中医药现代化发展的关键。双光子显微镜在中医药研究中的细胞成像、组织成像、在体成像中得到广泛运用，使中医药研究实现“可视化”创新，提供了更科学、更直观的证据。本文对双光子显微镜技术发展和优势，以及其在中医药领域的细胞网络、组织结构、活体成像等方面的应用进行阐述，并展望其更广阔的应用前景。

1 双光子显微镜技术简介

1.1 双光子显微镜的发展

1990年，Denk等[1]将双光子激发现象应用到荧光显微镜中，发明了第一台双光子显微镜。初代的双光子显微镜在技术方面有单一成像、采集频率不足、体积较大等缺点。近年来，为了突破单一成像的技术限制，Jérme Lecoq[2]团队在2014年研发出一种可以同时在大脑2个区域进行成像的双光子显微镜，可以观察小鼠2个脑区之间的相互作用。其后Mengke Yang等[3]研发了一种多区域的双光子实时体内探索器，这种探索器可以很容易对体内多区域神经元进行探索，可以研究全脑的神经环路。Daniel Barson[4]团队最新研发出一种可以同时观察局部神经元功能和整个大脑网络的正交轴显微镜，其中介观显微镜位于大脑上方，双光子物镜则位于水平方向，这样可以同时进行介观和双光子成像。这种方法也能够识别远距离皮层网络的椎体神经元和表达血管活性肠肽的中间神经元的行为状态相关的功能连接。为了更好地监视神经元的活动，了解大脑中的信息处理过程，Jianglai Wu等[5]研发出一种每秒高达3 000帧和亚微米的空间分辨率成像的双光子显微镜，该设备可以检测固定的清醒小鼠大脑表面以下345 μm的超阈值和亚阈值电活动。Tong Zhang[6]团队相继研发了一个具有400个照明光束的双光子显微镜，该显微镜以高达1 kHz的速率共同采集95 000～211 000 μm2的区域，可以在清醒小鼠的大脑中观察到微循环血流、快速静脉收缩和神经元钙离子的增高，并具有毫秒级的定时分辨率。而为了使双光子吸收更有效，Tomoaki Kinjo等[7]研发出一种名为2paCRY2的CRY2变体，该蛋白可以通过蓝色荧光蛋白的共振能量转移被双光子激发更有效的激活，使双光子激发效率更高。

以上的技术发展都使双光子显微镜在成像速度更快、分辨率更高和激发更有效等方面提高。而从传统的双光子显微镜发展到微型双光子显微镜更是使该技术得到质的飞跃。双光子显微镜创始人Denk[8]团队在2001年研制出第一代的微型双光子显微镜，为该方向奠定了理论基础。接着各个研究团队在微型双光子显微镜的分辨率和头戴重量等相关技术上不断改进更新[9-10]。2017北京大学的程和平院士团队[11]研制出新一代的微型双光子显微镜。见图1。该团队设计了新型920 nm空心光子晶体光纤和高速双轴微机电扫描仪等最新配件，最重要的是该微型双光子显微镜重量只有2.2 g，可以实现多探头佩戴和多颅窗不同脑区的长时间监测。并且这种微型双光子显微镜能研究更多样的动物行为，例如亲子护理、社交等社交行为或者进食和睡眠等自然行为。

双光子吸收是指在强光激发下，递质分子吸收第一个光子达到虚能级之后，在飞秒时间内收第二个光子，获得足够的能量，从而跃迁到达激发态的过程。双光子吸收是目前在生物学标本中应用最为广泛的非线性光学效应。由于具有这种特殊的光学效应，双光子显微镜已经被运用到各个领域，包括从分子到网络，细胞到组织，离体到在体以及生理病理等多个层次。从细胞成像开始，Philippe Bousso等[12]通过双光子显微镜对胸腺培养物中的胸腺细胞发育和细胞接触进行了实时分析。接着，利用双光子显微镜技术具有成像深度深和光毒性低的特点，MichaelD.Cahalan等[13]发现双光子显微镜与指示剂分子的结合可以阐释淋巴器官組织中的T细胞和B细胞的编排，可以揭示免疫应答基础的细胞协同作用。Jing W.Wang等[14]则在2003年运用双光子显微镜结合钙成像技术揭示了果蝇中可以被气味激活的大脑活动图谱。从此，双光子在体成像技术更多运用到神经科学的领域。在神经元和胶质细胞成像中，有研究发现听觉感觉皮层中神经元组的回声反应优先发生在接近神经元最佳频率的的地方[15]，还有研究建立了长时间监测清醒猕猴的皮层神经元钙信号[16]，另有研究发现胡须刺激和微脉管刺激会影响皮层星形胶质细胞的钙离子信号[17-18]。在树突和树突棘成像方面，北京大学深圳研究生院的甘文标团队首次用双光子显微镜证明了大脑皮质的大部分树突棘稳定存在于生命过程[19]。该团队在后续的研究中还证明大脑皮质的树突棘是作为长期信息存储的结构基础[20-23]。双光子显微镜还可用于监测小鼠皮层中间神经元的树突形态[24]。在血管成像中，结合荧光标记技术可以将老鼠耳朵皮肤深度超过100 μm的3D血管清晰地显示出来，从而提供整个血管网络的信息[25]。

除上述应用以外，近年来双光子显微镜还与光遗传、化学遗传和光纤记录等技术在神经科学领域被广泛结合运用。例如结合光纤记录技术，在双光子显微镜下发现抗抑郁药物可能通过选择修复前额叶皮质的树突棘发挥作用[26]。利用光遗传学原理，用双光子显微镜本身的激光对神经环路进行闭环刺激，可以实现在行为学实验中“实时”操纵神经环路[27];对眼额叶皮质的有关喂养和社交的神经元进行5秒的光刺激可以促进喂养和社交行为[28]。结合化学遗传技术，研究发现社会刺激可以诱导下丘脑室旁核内催产素神经元的激活，以促进雄性小鼠的社会行为[29]。

1.2 双光子显微镜的特性与优势

双光子显微镜在细胞成像、组织成像和在体成像研究中都具有不同的优势和特点。见图2。对于细胞成像来说，典型的双光子脑部系统通常能够达到亚微米级的空间分辨率，能够满足细胞精细结构的成像的研究[30]。例如用追踪单个细胞的方法了解嗅球中的球旁细胞的迁移过程[31]。在组织成像研究中，光毒性和光漂白性低对于组织来说十分重要。双光子的激发发生在焦点附近，使其激发光可以穿透更深的标本，同时光毒性和光漂白性也低。这种特性适合于进行各部分组织结构和动力学研究[32]。例如，有研究将其运用于观察基底细胞癌和恶性黑色素瘤等不同病变皮肤的形态学特征[33];有研究发现子宫黏膜中的CD8+常驻记忆细胞可以独立于局部记忆或者淋巴组织增生而自主调节局部免疫监测[34]。在活体成像研究中，双光子显微镜系统通常采用波长较长的红外激光作为激发光源，这种光源的波长在生物组织中具有较好的穿透性，可以达到数百微米的成像深度[35]。所以它可以在活体内实现对分子事件的动态、实时、连续监测，并且能够揭示生物分子的相互作用过程的时间、空间关系[36]。适用于上述列举的神经元和胶质细胞成像、树突和树突棘成像和血管成像等。

2 双光子成像技术在中医药研究中的应用

目前，双光子显微镜技术在中医药研究中已经涵盖了细胞、组织及活体成像。见表1。

在细胞成像研究中，发现相关的中药大分子可以促进癌细胞的凋亡，为中医药治疗癌症提供实验依据。在组织成像研究中，双光子显微镜观察中药提取物和方剂对肾脏、肝脏、肠组织的影响，结果显示中药提取物和方剂可以有效改善肾小球肾炎、肝纤维化、慢性炎性肠病等临床疾病。为了更准确阐释中医药治疗疾病的临床疗效，相关的活体动物研究是必不可少的。在活体成像研究中，研究者运用双光子显微镜观察中药提取物和方剂对脑血管疾病和阿尔兹海默症疾病模型的影响，明确了中医药在脑血管疾病和神经系统疾病中的作用，同时，也证明针灸可以升高穴位附近肌肉的Ca2+水平。下面将从细胞成像、组织成像、活体成像3个方面论述双光子显微镜在中医药领域中的应用。

2.1 中医药应用中的细胞成像

利用双光子显微镜进行的细胞网络成像具有以下4个优点：1）具有单细胞甚至亚细胞分辨率;2）可以同时记录到上百甚至更多个神经细胞的活动;3）能够明确记录每个细胞的相对位置以及细胞类型;4）结合电生理方法，可以将神经元的活动精确到单个动作电位[39]。因此双光子显微镜技术被广泛运用到中药、方剂等相关的细胞研究中。

中药在临床上治疗癌症时有很好的疗效，但是各类中药主要的作用成分和机制还不够明确。双光子显微镜在中药研究中的最早应用是研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用。天花粉蛋白是从中草药瓜蒌根中提取的一种核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤和抗HIV作用。张春阳等[40]应用双光子显微镜结合特异性荧光探针首次观察到天花粉蛋白诱导人绒癌细胞凋亡过程中活性氧自由基和细胞内钙离子的变化。结果显示天花粉蛋白诱导的钙离子升高和自由基的形成参与了其诱导人绒癌细胞的凋亡过程，且自由基的形成与钙离子升高有关。该研究也为后续中医药领域的细胞研究建立了一种在单细胞层次适时、无损伤、多参数观察活细胞的方法。接着，在相关中药诱导癌细胞的后续研究中，缪冬映[41]发现中药苦参、山豆根等的主要成分苦参碱能够通过抑制重要的信号通路，抑制结肠癌细胞生长，并且能够诱导结肠癌细胞发生凋亡。其研究应用双光子显微镜观察细胞的凋亡，结果发现加入苦参碱后结肠癌细胞培养在不同时间点均出现明显的生长抑制，并随着药物浓度的提高和时间的延长而增强。

2.2 中医药应用中的组织成像

双光子显微镜组织成像的标本有很多种类，例如肾、肝、心、肠和脑等。同时双光子显微镜所需的特殊激发光可以控制分子荧光开关技术用于活体荧光成像，从而获得焦平面15 nm的分辨率，对亚细胞结构有很好的分辨率，而其极低的组织损伤也使得很多生物过程得以长时间观察，是中医药研究组织形态学的一大优势[42]。

苦豆子是一味具有清热解毒、祛风除湿疗效的中药，常用于治疗痢疾、湿疮等疾病。氧化苦参碱是从中药苦豆子中提取的成分，是苦参碱的N-氧化物。柴宁莉等[43]运用双光子显微镜技术观察经尾静脉注射红色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞8周后的肝脏组织，发现氧化苦参碱和骨髓间充质干细胞联合观察组的肝脏脂肪变和纤维化程度减轻，肝细胞脂肪变和坏死较轻。同时检测血清发现联合观察组的ALT、AST水平也更低。结果表明氧化苦参碱协同骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的效果优于这2种药物单独使用，且未出现不良反应，这给临床治疗肝纤维化提供新的途径。同样，雷公藤作为治疗风湿顽痹的要药，在现代临床中也常用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征等肾脏疾病。雷公藤甲素是雷公藤中最重要的活性成分，在雷公藤治疗肾病的机制中成为研究热点[44]。李亚妤等[45]先后在2个研究中证实了雷公藤甲素对局灶节段硬化性腎小球肾炎（FSGS）的治疗效果以及相关的机制。2个研究中采用切除5/6肾制备FSGS模型，均分为雷公藤低、中、高剂量组和模型组。研究通过观察各组大鼠一般情况和尿蛋白定量变化以及在双光子显微镜下观察肾组织病理形态等指标，结果显示雷公藤甲素可以明显增加FSGS大鼠总体生存率，而组织切片雷公藤甲素各组与对照组相比大鼠肾皮质uPAR、β3整合素表达增强，且高剂量组优于低剂量组。该研究中还发现μPAR和β3整合素对足细胞损伤具有调控作用，而足细胞损伤在FSGS疾病中发挥了重要的作用，所以该观察组再后面的研究主要证实Synaptopodin蛋白在雷公藤甲素治疗FSGS的作用。同样通过双光子显微镜观察疾病模型大鼠的肾脏组织切片病理形态变化及尿蛋白等指标，发现雷公藤甲素确能减少FSGS肾病大鼠模型24 h尿蛋白定量以及保护肾功能。而相关机制与雷公藤甲素能上调Synaptopodin蛋白的表达，减少肾组织足细胞的损伤有关[46]。

方剂在中医药治疗疾病的效果十分显著，但是同样在机制方面缺乏直接的科学证据。双光子显微镜在经方的研究中也发挥着重要的作用。参苓白术散是《太平惠民和济局方》中的名方，主要治证由脾虚致湿所致。在已证实参苓白术散可以减轻慢性炎性肠病（IBD）症状，同时可以改善肠上皮黏膜屏障的基础上，游宇等[47]通过双光子显微镜观察IBD小鼠模型的肠组织切片的自噬及相关蛋白表达情况，发现参苓白术散明显改善IBD小鼠的隐血、便血和病理改变等，且增加肠上皮细胞的自噬，进一步证实参苓白术散抗IBD的作用与其调节肠上皮细胞的自噬有关。

2.3 中医药应用的活体成像

活体光学成像主要是采用生物发光和荧光2种技术。双光子使用红外波段的超快激光作为光源，利用光学非线性效应实现对样品的三维、四维甚至实时监测[48]。由于红外光对生物组织的杀伤作用相对较小，因此研究者可利用此技术对生物样品进行活体动态观察。同时，由于长波长的长激光在组织中具有很高的穿透深度[49]，双光子显微镜自诞生以来是目前应用最广泛的活体脑光学成像方法[50]。对于血管相关疾病和癌症的研究和治疗学，非常需要在颅内发展穿透深度深和高信噪比的体内荧光成像，以观察血管内形态和血流动力学[51]。在中医药领域，双光子显微镜已有血管疾病和神经疾病的相关应用。

谭莉萍等[52]制备大鼠急性血瘀模型后，采用双光子活体成像技术，对小鼠脑血管闭塞-溶栓过程进行实时监测，并观察血液流变学及凝血功能等指标。结果显示银杏叶提取物在血液流变性、凝血功能、血管内皮功能、炎性反应应答及氧化应激等方面具有调控作用，能够促进脑部微血管栓塞部位的血液流动，加快栓块溶解。提示银杏叶提取物可有效防治脑部和周围血流循环障碍。在同样中医药治疗大脑血管疾病的研究中，Shen Liu等[53]通过制备永久性局灶性中动脉阻断脑缺血模型（pMCAO），在双光子显微镜下观测微血管结构和脑内微循环。结果显示在小鼠大脑中动脉永久阻断后6或24 h，通心络胶囊可改善神经功能缺损，减少梗死面积，减弱血脑屏障破坏，保护微血管结构，增加毛细血管流速和体积流量，抑制白细胞-内皮细胞的相互作用，且治疗效果呈剂量依赖性。同样，另一研究在双光子显微镜下发现血栓通可以提高APP/PS1小鼠的脑血流量，且淀粉样的斑块减小。这表明相关中医药有望成为治疗阿尔兹海默症的有效方案[54]。在针灸相关的研究中，Geng Li等[55]在小鼠后肢肌肉中转染GCaMP2 cDNA 2周后，在麻醉状态下固定小鼠之后针刺足三里，通过双光子显微镜检测Ca2+水平。结果显示由针刺的机械运动产生的声切波可以使小鼠后肢肌肉的Ca2+增加。

3 小结

双光子显微镜在中医药研究中发挥巨大的优势。1）双光子显微镜能够观察在使用各类中药提取物后细胞甚至亚细胞水平上的细胞结构形态、细胞运动、分子相互作用等现象和过程进行直接的成像监测，已用于中药提取物对于肿瘤细胞的作用及其机制研究。2）因其具有光漂白性和光毒性小的优势，在各种中药及方剂研究肾脏、肝脏和肠组织中已得到有效运用。3）活体成像方面，中医药研究证明银杏叶提取物和通心络胶囊可以治疗血管类疾病;血栓通可以作为治疗阿尔兹海默症的潜在方案;而针灸也被证明可以提高相应穴位附近肌肉的Ca2+水平。综上所述，双光子显微镜作为现代最重要的光学显微镜，已经广泛运用到与中医药有关的细胞、组织和活体成像研究中。双光子显微镜技术与中医药研究的结合，可以为中医药治疗疾病提供更科学直观的证据，还可以阐释更多的中医基础理论，加快中医药现代化发展的进程。

4 討论

双光子显微镜技术在中医药研究中广泛应用仍然存在很多问题。首先，现在的中医药研究都是基于染料、病毒等荧光标记技术上进行，但是这种方法有漂白性大、后期成像不稳定等缺点;其次，目前其应用于中医药的研究多是细胞及组织层面，在体成像和针灸的研究较少;最后，目前运用的多是传统的体积较大的双光子显微镜，微型双光子还未用到社会行为和自然行为的研究中。在今后的中医药研究中，使用携带特异性启动子的转基因鼠[56-57]将成为双光子显微镜在中医药研究的助力工具。此外，中医药研究还可以拓展针灸在体成像方面的研究，并且结合光遗传、化学遗传的技术研究中医药对神经元或者胶质细胞等神经细胞的作用，以及和学习、记忆等重要神经环路中的关系。应用微型双光子显微镜还可以对活动范围广泛的自由移动动物的体细胞以及神经元的树突和棘突中的活动进行成像，让小鼠在没有情绪和压力的情况下进行使用皮内针等特殊针具干预，为中医药治疗情绪疾病和社会行为缺陷等情绪疾病提供新思路和新方案。综上所述，结合现代最新技术阐释传统中医基础理论和中药、方剂、针灸等治疗疾病的机制依旧是中医药领域的研究关键，可以为中医药治疗疾病提供新视角，推动中医药现代化的发展。

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（2020-05-10收稿 責任编辑：徐颖）