自血疗法对慢阻肺稳定期模型大鼠炎性反应相关指标的影响

孙丽凤 杨华 陈伟

摘要 目的：研究自血疗法对慢阻肺稳定期模型大鼠白细胞介素-2（IL-2）、IL-6及C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）水平的影响。方法：选取60只健康清洁级雄性Wistar大鼠作为研究对象，将其以随机抽签法等分成空白对照组、空白观察组以及自血疗法组。其中空白观察组及自血疗法组大鼠均由熏香烟联合气道内灌注毒素法制作慢阻肺稳定期模型。完成后予以空白对照组、空白观察组大鼠生理盐水灌服，自血疗法组大鼠则予以自血疗法干预。3组大鼠均进行30 d治疗，比较治疗前后血清IL-2、IL-6及CRP、PCT，血清基质金属蛋白酶-9（MMP-9）以及金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）变化情况。结果：治疗后自血疗法组大鼠IL-2、IL-6及CRP、PCT均低于空白观察组，但高于空白对照组（均P<0.05）。治疗后自血疗法组大鼠血清MMP-9以及TIMP-1均低于空白观察组，但高于空白对照组（均P<0.05）。结论：自血疗法可显著改善慢阻肺稳定期模型大鼠的炎性反应程度，降低血清MMP-9以及TIMP-1水平，可能成为临床治疗慢阻肺稳定期的有效手段之一。

关键词 慢性阻塞性肺疾病;稳定期;大鼠模型;自血疗法;炎性反应因子

Abstract Objective：To analyze the effects of autohemotherapy on the levels of interleukin-2 （IL-2），IL-6，c-reactive protein （CRP） and procalcitonin （PCT） in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD） in stable phase.Methods：A total of 60 healthy and clean male Wistar rats were selected and divided into blank control group， blank treatment group and autohemotherapy group by random lottery. Rats in the blank treatment group and the autohemotherapy group were modeled by cigarette smoking combined with intraairway toxin infusion. After modeling， the rats in the blank control group and the blank treatment group were drenched with normal saline， and the rats in the autohemotherapy group were given the autohemotherapy intervention. All rats in the three groups were treated for 30 days， the changes of serum IL-2， IL-6， CRP， PCT， serum matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and metalloproteinase inhibitor 1 （TIMP-1） before and after treatment were compared. Results：After treatment， the levels of IL-2，IL-6，CRP and PCT in the autohemotherapy group were lower than those in the blank treatment group， but was higher than the blank control group（all P<0.05）.After treatment， serum levels of MMP-9 and TIMP-1 in rats from the autohemotherapy group were lower than those in the blank treatment group， but was higher than the blank control group （all P<0.05）.Conclusion：Autohemotherapy can significantly alleviate the inflammatory response， reduce serum MMP-9 and TIMP-1 of the model rats. It may be one of the effective methods to treat chronic obstructive pulmonary disease in stable phase.

Keywords Chronic obstructive pulmonary disease; Stable phase; Rat model; Autohemotherapy; Inflammatory cytokines

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.015

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）亦可称之为慢阻肺，主要是指一组以进行性气流受限为临床表现特征的慢性疾病，该病的发生可能和香烟烟雾等有害气体以及粉尘颗粒等引发的肺部炎性反应有关，慢性炎性反应导致的气道损伤、重塑以及修复是该病主要病理改变[1-2]。该病患者主要症状囊括反复咳嗽咳痰、呼吸困难，伴或不伴有胸闷等，如不予以及时有效的治疗，随着病情的不断进展，会累及其他脏器、系统，继而导致肺外不良反应的发生，从而对患者的生命健康安全造成极大的威胁[3]。迄今为止，关于慢阻肺的具体发病机制尚未完全明确，大多数研究学者认为其可能和免疫失衡、炎性反应、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、气道黏液过度分泌、细胞凋亡/组织重构等密切相关[4]。临床上针对慢阻肺尚無特异性治疗手段，因此，寻找一种积极有效的治疗手段显得尤为重要，亦是目前临床医务人员以及患者共同关注的热点。自血疗法是近年来所兴起的一种治疗手段，其主要机制目前已得到大量研究证实[5-6]：血中含有较为丰富的血细胞、酶类、激素以及补体等，通过自血疗法治疗可有效增强机体免疫力，并拮抗炎性反应因子的释放，减少嗜酸性粒细胞的合成、分泌，抑制乙酰胆碱等多种活性物质的释放。然而，关于自血疗法治疗慢阻肺稳定期的相关基础研究并不多见。由此，本文通过研究自血疗法对慢阻肺稳定期模型大鼠白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）及C反应蛋白（C-reactive Protein，CRP）、降钙素原（Procalcitonin，PCT）水平的影响，旨在探究自血疗法治疗慢阻肺稳定期的主要机制，继而为其临床应用提供理论依据，现作以下报道。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取60只健康清洁级雄性Wistar大鼠作为研究对象，将大鼠体质量（180±20）g，均由天津市山川红实验动物技术有限公司提供[许可证号：SCXK（津）2009-0001]。将所有大鼠均饲养在温度18～22 ℃，相对湿度50%～70%的条件下，光照时间一致，每天昼夜各12 h，食物与水不进行控制，适应性饲养7 d后进行实验。

1.1.2 药物 大肠杆菌内毒素（SIGMA公司，美国，货号：019034）;生理盐水（上海信谊金朱药业公司，货号：227693）。

1.1.3 试剂与仪器 染毒箱（上海玉研科学仪器公司，型号：PLY5000）;IL-2、IL-6及CRP、PCT检测试剂盒（均购自eBioscience公司，美国，货号分别为014207、102311、039148、026403）;MMP-9、TIMP-1检测试剂盒（均购自上海酶联生物科技有限公司，货号分别为019112、019430）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）分组方式：将60只健康清洁级雄性Wistar大鼠以随机抽签法等分成空白对照组、空白观察组以及自血疗法组，每组20只。2）慢阻肺稳定期大鼠模型的建立：通过熏香烟联合气道内灌注毒素法制作慢阻肺稳定期模型，即空白对照组大鼠予以正常空气呼吸，而空白观察组以及自血疗法组大鼠每天放置于染毒箱内被动吸烟（大前门牌过滤嘴香烟），吸烟频率为1支/次，30 min/次，2支/d，上午9：00及下午15：00各1支，连续熏烟30 d。实验开始后第1天以及第14天，空白观察组以及自血疗法组大鼠均予以乙醚吸入麻醉处理，随后于气道内分别滴注200 μL大肠杆菌内毒素与200 μL生理盐水混合溶液，当日不予以被动吸烟处理。然后经由上述方式造成慢阻肺，常规饲养14 d后达到稳定期，即完成慢阻肺稳定期大鼠模型的制作。

1.2.2 干预方法 待造模成功后，空白对照组、空白观察组大鼠分别予以生理盐水灌服治疗，使用剂量为1 mL/100 g，1次/d。自血疗法组大鼠则采用自血穴位注射疗法治疗，从第17天开始进行穴位注射，在每次注射时选择两穴点，包括肺俞穴（双侧）及肾俞穴（双侧），操作时轮流取穴，从大鼠的眼眶静脉丛提取其自体血，单穴点给予0.4 mL的自体血注射，频率为隔天1次，一共治疗6次。

1.2.3 检测指标与方法 比较治疗前后血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平，血清基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9）以及金属蛋白酶抑制剂1（Metalloproteinase Inhibitor 1，TIMP-1）水平的变化情况。其中血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平及血清MMP-9、TIMP-1水平以酶联免疫吸附法进行检测，具体操作务必以相关试剂盒说明书完成。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验;计数资料用例（%）表示，进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 治疗前后3组大鼠血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平 治疗后自血疗法组大鼠血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平均低于空白观察组，但高于空白对照组（均P<0.05）。见表1。

2.2 治疗前后3组大鼠血清MMP-9以及TIMP-1水平比较 治疗后自血疗法组大鼠血清MMP-9以及TIMP-1水平均低于空白观察组，但高于空白对照组（均P<0.05）。见表2、图1。

3 讨论

自血疗法主要是基于经络学说以及自体血液细胞多成分激发与调节机体免疫功能原理所发展而来的一种治疗疾病手段[7-9]。该治疗方法在慢肺阻稳定期的应用越来越受到更多医者的关注和认可。IL-2是一种调节体液免疫的重要细胞因子;IL-6属于多功能细胞因子之一，本质乃是一种多肽类物质，多种外源性刺激均可能促进正常细胞合成、分泌IL-6，是目前临床上应用较为广泛的反映机体炎性反应的敏感指标[10-12];CRP属于由肝脏合成的一种急性时相蛋白，在炎性反应以及感染等状态下显著升高，是用以评价机体炎性反应、感染严重程度的客观指标;PCT属于降钙素的前肽物之一，在正常生理状态下不表达或极低表达，一旦发生感染或炎性反应时，其水平大幅度上升[13-14]。目前，临床上已有不少研究报道证实，上述4项指标可用以反映慢肺阻的严重程度以及预后评估[15-16]。本文通过研究自血疗法对慢阻肺稳定期模型大鼠IL-2、IL-6及CRP、PCT水平的影响，以期进一步探讨自血疗法应用于慢阻肺的可行性和作用机制。

本文结果显示，治疗后自血疗法组大鼠IL-2、IL-6及CRP、PCT水平均低于空白观察组，但高于空白对照组，这说明了自血疗法可明显降低慢阻肺稳定期模型大鼠的炎性反应因子。分析原因，我们认为可能与该疗法有效促进机体免疫力的恢复以及抑制炎性反应递质的释放有关[17-18]。另外，治疗后自血疗法组大鼠血清MMP-9以及TIMP-1水平均低于空白观察组，但高于空白对照组，这提示了自血疗法应用于慢阻肺稳定期模型大鼠治疗中，可显著改善MMP-9以及TIMP-1水平。其中MMP-9属于明胶酶之一，可发挥降解气道与肺的细胞外基质、基质膜的作用，进一步引起肺泡表面以及肺弹性蛋白不可逆性损害以及肺结构重塑，在慢阻肺的发生、发展过程中起着至关重要的作用。另有相关研究报道证实[19-20]，MMP-9可通过趋化炎性细胞聚集，从而加剧肺组织炎性反应，导致肺组织结构的破坏，进一步引起气道重塑，最终引起气流阻塞。TIMP-1则属于MMP-9的一种内源性抑制剂，属于呼吸道重构的重要因子之一，与MMP-9共同作用参与支气管以及肺泡壁的进行性破坏以及不可逆呼吸道重构过程。正常生理状况下，MMP-9和TIMP-1处于相对平衡状态，若比值升高反映气道以炎性反应为主，若比值降低则反映以修复为主。因此，可推测自血疗法应用于慢阻肺稳定期模型大鼠中的主要机制可能和调节MMP-9和TIMP-1水平有关。

综上所述，自血疗法应用于慢阻肺稳定期模型大鼠的治疗中，可明显改善大鼠的炎性反应程度。此外，MMP-9和TIMP-1水平的调节可能是自血疗法治疗阻肺稳定期的重要机制。

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（2019-08-14收稿 责任编辑：王明）