细菌16S rDNA测序分析妊娠晚期孕妇感染B族链球菌对阴道微生态及母婴结局的影响

盛群英，林雅真，崔晓洁，张军能

(厦门市第五医院妇产科，福建厦门 361101)

女性阴道微生态与生殖健康具有密切关系。在正常情况下，阴道内微生物与宿主、环境保持生态平衡。当女性妊娠时，微生物种群随着妊娠与年龄的改变而改变[1]。正常孕妇阴道微生态中以乳杆菌为优势菌，阴道内pH值水平较低，小于4.5，为弱酸性。若阴道微生物生态破坏，多以乳杆菌数量下降，菌群多样性增加为特征。有文献报道，妊娠晚期孕妇阴道内微生物生态破坏可影响母婴结局，严重者可导致胎儿早产、胎膜早破等危险情况发生[2]。目前临床上多以传统方法从菌群多样性、密集度、机体炎症等方面评估阴道微生态，具有一定评估价值，但过程较慢且复杂[3]。核糖体亚基16S rDNA基因序列为鉴定细菌常用位点，且该位点存在于所有细菌染色体基因中，可分类鉴定阴道微生物菌群。为此，本研究将采用16S rDNA测序分析妊娠晚期孕妇阴道微生态对母婴结局的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年1—10月在本院建档的妊娠晚期孕妇3 700例为研究对象，年龄22～40岁，平均(30.92±8.89)岁；孕周28～40周，平均(26.49±13.48)周；孕次1～2次，平均(1.91±0.89)次。本研究经医学伦理会批准，所有孕妇及家属签署知情同意书。纳入标准：(1)孕周≥28周，早、中、晚胎动次数共5～10次；(2)经超声检查示单胎。排除标准：(1)合并心脑血管疾病；(2)沟通障碍或精神异常者；(3)先兆流产、前置胎盘等产科复杂情况；(3)检测前1个月内有阴道局部用药史。

1.2方法

1.2.1标本的采集 采用一次性无菌阴道拭子(浙江拱东医疗科技有限公司)在孕妇阴道里1/3侧壁取分泌物，采样过程中应避免接触采样区以外部位，采样后快速置入试管，并于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2B族链球菌性质的鉴定 以B族链球菌运送增菌显色培养基配套，已采集标本拭子送至实验室，置入35 ℃条件下的5%二氧化碳培养箱中18～24 h，B族链球菌运送增菌显色培养基呈胡萝卜色则为阳性。未显现胡萝卜色的B族链球菌运送增菌显色培养基再转入二分格、血平板，再置入于35 ℃条件下的5%二氧化碳培养箱18～24 h。二分格平板呈现胡萝卜色且菌落β溶血则B族链球菌阳性。二分格平板仅出现β溶血(二分格平板可诱导γ溶血B族链球菌出现β溶血)、血平板上可疑菌落则采用仪器鉴定明确后判定阳性，其余判定为阴性。

1.2.3提取DNA 使用Invitrogen DNA提取试剂盒完成DNA提取。采用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外微量分光光度法行DNA质检。

1.2.4设计引物和扩增PCR及产物提纯 16S rDNA扩增区V3-V4，采用F341、R806为通用引物，并在其5′端加适宜HiSeq2500 PE250测序的接头、index序列，特异性引物完成。5′-ACT CCT ACG GGR SGC AGC AG(F341)-3′为正向引物序列，5′-GGA CTA CVV GGG TAT CTA ATC(R806)-3′为反向引物序列。经稀释后的DNA为参照板，采用Invitrogen Platinum SuperFi高保真酶行PCR扩增，扩增体积(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，HotStarTaq DNA Polymerase 0.5 μL，5×Q-Solution 10 μL，100 mmol/L dNTP 0.5 μL，Primer各1 μL，UNG 0.3 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 26.7 μL。扩增条件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，10个循环；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，25个循环，最后于72 ℃ 10 min，4 ℃恒温；并保障扩增区高效、准确。检测PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳，后采用 DNA凝胶回收试剂盒，将PCR产物行切胶回收，提升产物纯度。采用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，严格按试剂说明书操作。测序反应PCR：1 μL BigDye，0.5 mL BigDyeseq Buffer，1MI M13或T7通用引物(3.2 pmoL/μL)，1 μL质粒DNA，1.5 μL ddH2O。96 ℃ 1 min，96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，25个循环，60 ℃ 4 min，4 ℃恒温，正反向测序。以ABI公司提供的标准品作为阳性对照。测序反应PCR产物用乙醇/EDTA沉淀法纯化，Hi-Di Formamide溶解DNA后，95 ℃变性4 min，迅速置冰中冷却4 min，然后在ABI3100XL基因分析仪上样电泳。

1.2.5测序结果分析 采用ABI Sequencing Analysis V5.4软件对测序结果进行低质量去除后，测序结果直接在NCBI的Blast进行序列比对分析，Megalign软件对序列进行聚类分析，观察样本中序列的相似性程度进行分类，统计信息。

1.2.6物种鉴定 将同序列与微生物参考数据库作对比分析获得同一物种分类信息，并采用QIIME软件将同源序列相似度为97%的物种归为同一物种。并采用RSP Classifier对各样本群落进行门、纲、目、科、属水平统计。质控菌株为参照标本：血链球菌ATCC10556、乳杆菌ATCC7830、普氏菌BNCC351994、加德纳菌ATCC 14018、双歧杆菌CICC6071、厌氧球菌ATCC27337，购于北纳生物科技有限公司。

上述方法中所有试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。对所有妊娠晚期孕妇随访至生产后3个月，随访率100%。观察晚期孕妇阴道微生态菌群及致病菌对母婴结局的影响。

1.3统计学处理 使用Miseq PE300行16S rDNA基因测序及生物学分析。对原始数据行质量控制后，提取物种序列采用Usearch系统对数据行去嵌合体与聚类分析，而后采用QIIME系统与16S数据库进行比较，最后得物种丰度表，并根据该物种丰度表进行物种分类、丰度、Alpha多样性、Beta多样性分析。采用SPSS22.0软件进行统计分析，计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1物种类别分析 共鉴定41 110个物种。依据物种在样品中丰度，计算个体样品间共同拥有与特别物种，根据对所有孕妇行物种聚类分析后发现，感染B族链球菌233例孕妇中检出特有物种4 522个，未感染B族链球菌3 467例孕妇检出特有物种6 577个，共同拥有30 011个物种。感染B族链球菌一侧物种总数少于未感染菌一侧。物种累积曲线由急速升高到缓慢升高，见图1，由此说明本研究结果较为可靠，样本充分。根据物种分类结果，将孕妇分为B族链球菌感染组(n=233)与未感染组(n=3 467)。

图1 物种及微生物群差异分析

2.2阴道微生态物种分类和丰度分析 选择各个物种中最高丰度序列为代表序列，使用核糖体数据库项目(RDP)法，将已知物种16S数据库与最高丰度代表序列行对比分析，并注释结果，将等级分为门、纲、目、科、属，并根据分类等级对B族链球菌感染组与未感染组做相应的物种解剖柱状图，得物种相对丰度图。结果显示，感染组厚壁菌门、拟杆菌门丰度小于未感染组(78.36%vs. 81.25%，6.13%vs. 8.71%)，且放线菌门大于未感染组(10.63%vs. 8.12%)。感染组芽孢杆菌纲、放线菌纲丰度高于未感染组(76.38%vs. 67.45%，5.77%vs. 4.43%)，梭菌、拟杆菌纲低于未感染组(10.24%vs. 11.98%，3.54%vs. 8.85%)。感染组双歧杆菌目、乳杆菌目丰度高于未感染组(10.56%vs. 5.33%，70.68%vs. 65.33%)，拟杆菌目、梭菌目低于未感染组(5.89%vs. 6.67%，12.47%vs. 15.33%)。感染组双歧杆菌科、西德梭状芽孢杆菌科、链球菌科丰度高于未感染组(11.12%vs.6.25%，8.34%vs. 5.90%，1.08%vs. 0.69%)，乳杆菌科、拟杆菌科低于未感染组(58.42%vs. 61.83%，1.00%vs. 2.08%)。感染组链球菌属、厌氧球菌属、双歧杆菌属丰度高于未感染组(1.95%vs. 0.87%，4.55%vs. 1.95%，9.09%vs. 0.31%)，加德纳菌属、普氏菌属、乳杆菌属及粪杆菌属、其他菌种丰度均低于未感染组(3.90%vs. 6.49%，3.25%vs. 5.19%，60.39%vs. 62.34%，0.32%vs. 0.65%，12.34%vs. 16.37%)。对物种丰度位于前20菌属行分类计数，结果显示感染组与未感染组中厚壁菌门的乳杆菌属无显著变化，但感染组中链球菌属、厌氧球菌属显著增加；感染组中属放线菌门的双歧杆菌增加，加德纳菌属下降，使放线菌门所有物种数显著增加；另感染组中拟杆菌门的卟啉单胞菌属、普氏菌属下降导致拟杆菌门所有物种数下降。

2.3多样性分析

2.3.1Alpha多样性指数分析 使用QIIME系统计算样本的Alpha多样性指数值显示，感染组物种数量低于未感染组(P<0.05)，见表1。

表1 Alpha多样性指数差异比较(%)

2.3.2Beta分析

2.3.2.1相似性分析 若统计R值>0，表示组间差异大于组内，分组合理；若R值<0，表示组间差异小于组内，分组较不合理。本研究计算R值=0.150，表示组间差异大于组内(P=0.001)。

2.3.2.2非度量多维尺度法(NMDS)分析 研究结果显示，两组样本距离相近，存在相似物种，但有相分离趋势。

2.3.2.3多响应置换程度(MRPP)分析 a为MRPP组间差异分析统计量，本研究计算a=0.019>0，表示组内差异小于组间；ED=0.504，表示值越大组间差异越大；P=0.001<0.05，表示差异有统计学意义。

2.4感染B族链球菌与妊娠结局的关系 感染组胎儿窘迫、羊水污染、早产、宫内污染发生率高于未感染组，差异有统计学意义(P<0.05)；且感染组发生胎儿窘迫、羊水污染、早产、宫内污染的风险(OR)是未感染组的8.562、7.297、7.156、7.280倍，见表2，提示B族链球菌感染本身或其造成的菌群变化与上述不良妊娠结局相关。

表2 感染B族链球菌与妊娠结局的关系[n(%)]

2.5感染B族链球菌与新生儿病理性结局的关系 感染组新生儿感染、窒息、病理性黄疸、肺炎发生率高于未感染组，差异有统计学意义(P<0.05)；且感染组发生新生儿感染、窒息、病理性黄疸、肺炎的OR是未感染组的4.929、3.852、5.000、3.619倍，见表3，提示B族链球菌感染或其造成的菌群变化与上述新生儿病理性结局相关。

表3 感染B族链球菌与新生儿病理性结局的关系[n(%)]

3 讨 论

女性阴道内微生态菌群正常情况下与内部环境相制约，形成以乳杆菌占绝对优势的阴道微生态环境，并维持动态平衡。有研究指出，妊娠期孕妇体内雌激素水平显著升高，且随着妊娠周期改变，妊娠晚期孕妇的激素水平高于妊娠早期孕妇，阴道内细胞通透性也随之增加，其生理改变导致黏膜屏障功能降低，使细菌快速滋生、繁殖，引起阴道微生态紊乱[4]。因此，妊娠晚期孕妇阴道微生态更易紊乱。若妊娠晚期孕妇阴道微生态发生紊乱可引发相关疾病，严重可威胁胎儿与母体生命[5]。因此，早期对妊娠晚期孕妇行相关检测具有重要意义。目前临床上多采用传统方法评价妊娠晚期孕妇阴道微生态。随着测序技术的发展，16S rDNA基因序列为分子鉴定细菌常用位点，在阴道微生态菌群分析中发挥较大优势。为此，本研究通过对妊娠晚期孕妇行16S rDNA测序分析阴道微生态，并对其母婴结局的影响进行分析。

16S rDNA是所有细菌染色体基因上相对DNA序列。有研究指出，16S rDNA在细菌DNA中含量高达80%，具有种类较少、含量大、相对分子质量适中、进化性好、保守性高的特点，能同时显示不同菌属间差异，并利用测序技术可得到该序列[6]。16S rDNA分析是利用细菌序列测序法对其行种属鉴定，包括细菌基因DNA提取、引物PCR扩增、产物纯化、测序、序列比较等，可快速获取细菌种属[7]。在妊娠中晚期健康孕妇阴道内包含偶尔、过路、常驻细菌，其中过路细菌包括消化链球菌、痤疮丙酸杆菌、肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。常驻细菌有乳酸菌、B族链球菌、大肠埃希菌、粪链球菌、梭菌、拟杆菌等。阴道乳酸杆菌是妊娠晚期健康孕妇阴道内有益细菌，正常情况下，孕妇阴道内机会性病原体与常驻细菌相互制约，达到相对平衡[8]。B族链球菌为寄生于人体泌尿生殖道、下消化道内的细菌。但由于妊娠晚期孕妇体内激素水平发生变化，且随孕周增加，使其阴道微生态菌群相互约制力遭受破坏，失去平衡，阴道pH值偏弱酸性[9]，导致B族链球菌成为机会致病菌。在临床上，妊娠晚期孕妇阴道中，B族链球菌感染常可导致不同程度的炎症和病理改变。孕妇泌尿生殖道内若发生B族链球菌感染，可改变母婴结局，造成不良影响，严重者引起新生儿死亡。因此，及时对高风险孕妇进行筛查，提供针对性的干预、治疗方法，可降低不良妊娠结局的发生风险，降低母婴患病率。本研究通过对妊娠晚期孕妇行细菌16S rDNA测序分析发现，孕妇阴道微生态中共鉴定出物种41 110个，其中感染B族链球菌的个体中存在4 522个特有物种，未感染组则有6 577个，两组共同拥有的物种达30 011个。其中共同物种多为常驻菌。既往资料显示，炎症表现显著的孕妇，阴道内细菌丰度较低[10]。本研究结果显示，感染组中双歧杆菌、链球菌增加，加德纳菌则减少。当阴道内发生B族链球菌感染时，双歧杆菌发生改变，有研究认为，阴道内感染与双歧杆菌增加有关[11]，增加的双歧杆菌使其阴道酸碱环境破坏，使阴道内加德纳菌生长受到抑制。另有文献报道，在阴道炎症疾病中，双歧杆菌与加德纳菌存在相互竞争作用，当加德纳菌数增长时，双歧杆菌生长受抑制，反之亦然[12]。另有研究发现，宫颈癌在发展过程中，可使阴道内加德纳菌属增加、乳酸杆菌属降低、物种多样性增加，说明加德纳菌属的繁殖可引发阴道pH值发生改变，抑制乳酸杆菌属生长，同时可破坏阴道内上皮细胞保护因子，导致病菌大量黏附、定植阴道表面，最终使其总物种多样性增加。 已有文献报道，感染B族链球菌严重威胁母婴安全，不仅可导致孕妇出现胎儿窘迫、羊水污染、早产、宫内污染等，还可导致新生儿出现感染、窒息、病理性黄疸、肺炎等并发症[13]。本研究结果显示，感染组胎儿窘迫、羊水污染、早产、宫内污染发生率高于未感染组，差异有统计学意义(P<0.05)；新生儿感染、窒息、病理性黄疸、肺炎发生率高于未感染组，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究采用分子生物技术对妊娠晚期孕妇行细菌16S rDNA测序同时对阴道微生态物种进行鉴定，发现部分孕妇存在B族链球菌感染，并对其从门、纲、目、科、属水平对细菌物种丰度进行分析，提示感染组孕妇阴道微生态环境已发生改变。

本研究纳入研究年限较短，可能使相关研究结果存在误差，待后期样本量扩大后再深入研究。另外，本研究仅发现B族链球菌感染可造成阴道内菌群变化，并与妊娠期母婴不良结局相关，但尚未有直接证据证明菌群失调与不良妊娠结局的因果关系，有待进一步研究。

综上所述，细菌16S rDNA测序可准确反映妊娠晚期孕妇阴道内微生态情况及感染B族链球菌对母婴结局的影响，为该病的干预、治疗提供参考，可一定程度上减少疾病对母婴结局的影响。