慢性乙型肝炎中医证型与HBV-DNA的相关性研究

郭慧娟，郭 朋，张引强，郑 颖，李 琦△

中国中医科学院西苑医院：1.检验科；2.肝病科，北京 100091

我国约有1亿慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年很多该病患者死于与CHB相关的肝硬化、肝癌等疾病[1]。CHB属于中国传统医学“胁痛”“黄疸”“虚劳”等范畴[2]。辨证论治是中医的核心，确定证型是中医治病的前提[3]。西方医学认为CHB是因为患者被乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。西医和中医对CHB有着不同的治疗措施。有研究报道，中西医联合治疗CHB要优于单独西医治疗或单独中医治疗[4]。本文把中医的“证”和西医的检测指标结合一起[5]，探索二者之间的联系，使中医辨证得以客观化和标准化。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年2-12月在本院肝病科门诊就诊的119例初诊CHB患者，其中男63例，年龄22～80岁，平均(56±21)岁；女56例，年龄27～87岁，平均(50±16)岁。通过医院信息系统收集所有患者的证型以及HBV-DNA等实验室检查结果，参照相关标准[6-7]分为湿热内蕴组(12例，其中男8例，女4例)、肝肾阴虚组(18例，其中男11例，女7例)、肝郁脾虚组(45例，其中男22例，女23例)、气滞血瘀组(44例，其中男22例，女22例)。各组年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会审核通过，所有患者及家属均知情同意，并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 DNA检测仪：Cobas z480 PCR仪(德国罗氏公司)；检测试剂来自上海之江生物科技；分子诊断仪器：美国ABI公司的Gene Amp 7500 ABI实时荧光核酸检测仪。

1.3方法 检测不同中医证型组患者的HBV-DNA水平。HBV-DNA拷贝数阴性标准：≤100 IU/mL。对HBV-DNA>100 IU/mL的标本进行X蛋白区、前C区和C区基因位点测序，测序区间为nt1652～nt1976。

1.4诊断标准

1.4．1西医诊断标准 参照《慢性乙型肝炎诊断标准(2010年版)》[8]：既往乙型肝炎病史或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性超过6个月，目前HBsAg和(或)HBV-DNA仍然为阳性者，即可以诊断为慢性HBV感染。

1.4.2中医证型诊断标准 中医证型的分型参考《病毒性肝炎中医辨证标准》[6]以及《中医诊断学》[7]相关标准，将CHB分为4种证型：湿热内蕴型、肝肾阴虚型、肝郁脾虚型及气滞血瘀型。

2 结 果

2.1不同中医证型组HBV-DNA阳性率及平均拷贝数比较 4组HBV-DNA阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中湿热内蕴组与其他3组、肝肾阴虚组与其他3组HBV-DNA阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；肝郁脾虚组和气滞血瘀组HBV-DNA阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组HBV-DNA平均拷贝数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中湿热内蕴组与肝郁脾虚组、气滞血瘀组比较，差异均有统计学意义(P<0.05),肝肾阴虚组与气滞血瘀组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，肝郁脾虚组和气滞血瘀组比较，差异有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 不同中医证型组HBV-DNA阴性率、阳性率及平均拷贝数比较

2.2不同中医证型组基因突变情况比较 对HBV-DNA>100 IU/mL的标本(共50例)进行DNA测序。湿热内蕴组、肝肾阴虚组、肝郁脾虚组、气滞血瘀组的核苷酸突变率分别为90.0%(9/10)、70.0%(7/10)、66.7%(10/15)、60.0%(9/15)，但差异无统计学意义(P>0.05)。湿热内蕴组、肝肾阴虚组、肝郁脾虚组、气滞血瘀组人均核苷酸突变数为2.30、1.90、1.47、1.60个。统计这10个核苷酸位点，突变率位于前3位的分别是A1762T、G1764A、G1896A。核苷酸突变率最高的2个位点分别是nt1762和nt1764。见表2。

表2 不同证型组核苷酸突变数量统计(n)

3 讨 论

在4组中，以湿热内蕴组HBV-DNA阳性率最高，说明HBV的复制与湿热具有高度联系。有研究发现，在一定程度上，HBV复制的活跃程度是与湿热轻重呈正相关的[9]，即HBV复制越活跃，其湿热之邪越重。血清HBV-DNA是HBV复制和传染性的重要标志物，在HBV感染者血清中，HBV-DNA结果可持续阳性。中医理论认为，HBV-DNA可以归属于“疫毒”。从微观辨证来看，HBV-DNA为中医之“疫毒”“邪气”。人体“正气”可理解为西医的免疫系统。关于CHB不同证型的HBV-DNA病毒载量的比较有很多的报道，但HBV-DNA阳性率比较的报道较少。本研究得出：湿热内蕴组的HBV-DNA阳性率最高，与另外3组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝肾阴虚组HBV-DNA阳性率与另外3组相比，差异也有统计学意义(P<0.05)；肝郁脾虚组和气滞血瘀组的HBV-DNA阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。有报道称，HBV拷贝数与湿热程度密切相关，湿热越重者HBV拷贝数越高，测定HBV-DNA水平可以作为中医辨证中湿热的客观指标[10]。本研究中湿热内蕴组与肝郁脾虚组、气滞血瘀组的HBV-DNA拷贝数差异有统计学意义(P<0.05)，并且4组中湿热内蕴组HBV-DNA平均拷贝数最高，说明病毒复制能力在湿热内蕴组是最强的。

HBV-DNA长链主要分为P、C、X、S 4个区，能够编码蛋白质。本研究对HBV-DNA阳性的患者进行核苷酸检测，从nt1652～nt1976对T1753、T1754、T1758、A1762、G1764、C1766、T1768、G1862、G1896、G1899这10个基因位点进行测序，发现湿热内蕴组HBV-DNA阳性患者核苷酸突变率最高，达90.0%，其次是肝肾阴虚组，基因突变率为70.0%，接下来为肝郁脾虚组和气滞血瘀组，突变率分别是66.7%和60.0%。但是这4组的基因突变率差异无统计学意义(P>0.05)。考虑可能是本研究选取的病例数太少所致，以后在研究中还要增加病例数，减少因抽样所引起的误差。这4组的人均核苷酸变异个数分别是2.30、1.90、1.47和1.60个。本研究50例HBV-DNA阳性的患者核苷酸突变的总数为88个，以碱基改变为计数基准，其中核苷酸突变率最高的是A1762T，占核苷酸突变总数的27.3%(24/88)，其次为G1764A，占26.1%(23/88)，第3为G1896A，占19.3%(17/88)。核苷酸突变率最高的2个位点分别是nt1762和nt1764，与相关的报道结果大致相同[11]。这2个位点皆与肝损伤和E抗原假性转阴相关。有研究表明，HBV的突变与HBV导致的慢性肝脏疾病的长期感染密切相关[12]。本研究发现：人均A1762T突变在湿热内蕴组、肝肾阴虚组、肝郁脾虚组和气滞血瘀组分别为0.7、0.6、0.3、0.4个；人均G1764A突变在湿热内蕴组、肝肾阴虚组、肝郁脾虚组和气滞血瘀组分别为0.8、0.5、0.3、0.3个。相关研究指出，肝损伤及肝病进程与HBV的BCP区、PreC区和C基因区突变相关，特别是影响E抗原前体表达的nt1762和nt1764双突变，此双突变与肝损伤直接相关[13]。

由于时间有限，样本例数较少，本研究只做了大致趋势的说明，为了避免偏倚，未进一步分析。希望能在以后的研究中增加更多的数据，来研究突变位点和中医证型的关系。