中性和石灰性土壤有效磷测定的影响因素

李金娟

（甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所（甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所），甘肃兰州 730070）

磷是植物体内含量仅次于氮和钾的元素，也是作物生长不可或缺的营养元素。土壤有效磷是土壤中能够被植物吸收利用的磷，其含量的高低极大程度上反映了土壤中磷元素的储备量和供应力，是判断土壤肥力的一个重要指标。准确测定土壤中有效磷养分含量，了解其供应状况，是保证作物高产、优质、高效、精确施肥量的最基础和最关键环节，对提高作物产量具有重要参考价值[1]。常规土壤养分测定中，中性和石灰性土壤中有效磷的提取和测定较为复杂，涉及的影响因素较多，同一土壤由于测定条件不同往往测定结果不同[2]。而目前的研究针对中性和石灰性土壤有效磷测定条件控制的研究较少[3-5]。因此，本研究以LY/T 1232-2015《森林土壤磷的测定》中的碳酸氢钠浸提- 钼锑抗比色法为标准方法，以实验室标准物质为质控样，通过磷标准曲线标定、浸提剂pH 值、是否添加活性炭、提取温度、显色时间5 个方面进行试验，获得相应的质控方法，以此探索提高土壤有效磷检测结果准确性的路径，优化其检测方法，提高土壤有效磷测定的准确性，从而提高土壤有效磷的检测效率，为土壤施肥技术和作物产量提高等提供充足的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料 质控样分别为来源于中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所的三种标准物质，见表1。

表1 三种标准物质（质控样）信息

使用的仪器分别为JM-B10002 型分析天平，感量为0.01 g； Cary50 紫外分光光度计，可在880 nm 波长处测读吸光度；国华CHA-S 气浴恒温振荡器；精密酸度计。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制 0.5 moL/L 碳酸氢钠（pH=8.5） 浸提剂配制：称取3 份42.0 g 碳酸氢钠（NaHCO3），分别加蒸馏水至近1 L，分别用2 moL/L 氢氧化钠溶液调pH 值为8.0、8.5、9.0，然后分别定容至1 L，贮存于聚乙烯瓶或玻璃瓶中备用。

酒石酸锑钾溶液（0.3%）配制：称取酒石酸锑钾0.30 g溶于100 mL 水中。

钼锑贮备液配制：称取钼酸铵10.0 g 溶于约60℃的 300 mL 水中，冷却。量取浓硫酸181 mL，边搅拌边缓缓倒入钼酸铵溶液中，再加入提前配制好的0.3% 的酒石酸锑钾溶液，冷却后用蒸馏水定容至1 L，摇匀贮存于棕色试剂 瓶中。

钼锑抗显色液配制：称取0.5 g 抗坏血酸溶于100 mL钼锑贮备液中，现配现用。

1.2.2 磷标准曲线绘制 分别吸取5 μg/mL 的磷标准溶液0.00、1.50、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL于8 支50 mL 容量瓶中，分别加入10.00 mL 碳酸氢钠提取剂和5 mL 钼锑抗显色液，用蒸馏水稀释定容至刻度，摇匀，分别在20℃、25℃、30℃三个温度梯度下显色30 min（温度由恒温振荡器设置控制温度）。显色环境和温度根据实际试验过程中的结果进行调整。然后以上述标准系列溶液的磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线，计算回归方程。

1.2.3 土壤有效磷的测定 分别称取2.50 g 三种质控标准物质于干燥塑料浸提瓶中，每个质控样称取三份，分别加入pH 值 为8.0、8.5、9.0 的0.5 moL/L 碳 酸 氢 钠 浸 提 剂 50.0 mL，用塑料盖盖紧，于20℃、25℃、30℃三个温度梯度下的恒温振荡器上振荡（30±1）min，然后用无磷滤纸过滤入试管中，作是否添加活性炭的对照。在浸提当天，吸取过滤液10 mL 于干燥的50 mL 容量瓶中，加入1 滴2，4-二硝基酚指示剂，用硫酸及氢氧化钠溶液将溶液pH 值调至刚呈微黄色，再缓慢加入钼锑抗显色剂5.00 mL，加液同时摇动瓶身以排出二氧化碳气体，之后充分摇匀并用蒸馏水定容。分别在20℃、25℃、30℃三个温度梯度下显色30 min（温度由恒温振荡器设置控制温度）后，在880 nm 波长处比色，测吸光度。以空白溶液（10.00 mL 浸提剂代替土壤滤出液，同上处理）为参比液，调节分光光度计的零点。同时作空白对照。

1.2.4 结果计算 相关计算公式如下：

其中，WP为有效磷含量（mg/kg），C为从工作曲线上查得显色液的磷浓度（μg/mL），V为显色液体积， 50 mL，ts为分取倍数；K2为由风干土样换算成烘干土样的水分换算系数，m1为风干土样质量（g）。

2 结果与讨论

2.1 有效磷标准曲线的影响因素 本研究选取了20、25、30℃三个显色环境温度分别进行磷标准溶液的显色反应，结果如表2 所示。有效磷标准曲线的R2值必须大于或等于0.999 0 才为合格，方可用于有效磷的测定。在恒温振荡器恒温显色环境中，显色反应在20℃时，试验中观察到低浓度点的标准溶液几乎不显色，标准曲线的相关系数远远达不到0.999 0以上，标准曲线不合格。显色反应在25℃时，低浓度点标准溶液几乎不显色，标准曲线相关系数勉强达到了0.999 0 以上。而在30℃时，加入显色剂显色30 min 后可以明显观察到各个浓度点标准溶液均呈现不同深浅的蓝色，且高浓度点的蓝色显著深于20℃和25℃处理的，对各个点计算标准方程后发现，此条件下的标准曲线合格，相关系数R2远高于0.999 0，达到了0.999 9，标准曲线理想。以上结果表明，随着显色环境温度的升高，显色反应显色越充分，标准曲线相关系数R2值越高，标准曲线也越理想。30℃显色环境温度下，标准溶液显色最为充分，标准曲线相关系数R2达到了0.999 9，逼近于最高值1，有效磷标准曲线最为理想。

表2 不同显色条件对有效磷标准曲线的影响

2.2 浸提剂pH 值对土壤有效磷测定的影响 实验室实际检测工作中，碳酸氢钠浸提剂的pH 值往往会随着存放时间的增加而增加，成为影响土壤有效磷测定的一个重要因素。本研究选取了三个不同pH 值的碳酸氢钠溶液作为浸提剂，分别对表1 所示的三个质控样品进行有效磷的测定。结果如表3 所示，随着碳酸氢钠浸提剂pH 值的升高，土壤有效磷的测定值也在升高。对比三种pH 值浸提剂提取的有效磷测定值，同一标准物质，当碳酸氢钠浸提剂pH 值为8.5 时，有效磷测定值最接近于标准物质的认定值，说明在土壤有效磷测定过程中，碳酸氢钠浸提剂需要现配现用或者将浸提剂的pH 值调至8.5 保存。

2.3 活性炭对土壤有效磷测定的影响 本研究为探测活性炭在土壤有效磷检测中是否必要，选取同一质控样品GBW07413a（ASA-2a），在相同试验条件下，以是否在浸提液中加入活性炭为变量，对该样品进行了5 次检测，结果如表4 所示。添加活性炭后，质控样品有效磷含量对比未添加活性炭后含量，结果均在认定值质控范围内，且结果中有效磷含量增加的3 次，减少的2 次，无明显规律。说明是否添加活性炭对土壤有效磷测定的影响较小，可以忽略不计。

2.4 提取温度对土壤有效磷测定的影响 本研究选取了早春（15℃）、初夏（25℃）、盛夏（30℃）三个不同提取温度下，对表1 中三个质控样品提取的有效磷含量进行分析，如表5所示。结果表明，三个不同的质控样品，在15、25、30℃三个提取温度下，有效磷含量的测定结果均统一呈现出随着提取温度的升高而增加。说明提取温度对土壤有效磷含量的测定影响较大，且三个不同有效磷含量的质控样均在25℃提取温度下最接近于认定值。因此，在实验室实际检测工作中，需要对提取温度进行严格控制，震荡提取时需要在设定恒温下进行，以保证有效磷检测数据的准确性，以提取温度25℃为最优。

2.5 显色时间对土壤有效磷测定的影响 本研究对钼锑抗显色25、30、35 min 三个不同显色时间下三个质控样品提取的有效磷含量进行分析，如表6 所示。结果表明，随着显色时间的增加，有效磷含量测定结果均统一呈现出随着显色时间的延长而增加。说明显色时间对土壤有效磷含量的测定有显著影响，且三个不同有效磷含量的质控样均在显色反应进行30 min 时测定的结果接近于认定值。因此，在实验室进行土壤有效磷含量测定时一定要控制好加入钼锑抗显色液后的显色反应时间，以保证有效磷检测数据的准确性，以显色反应30 min 为最优。

表3 不同pH 值浸提剂对土壤有效磷测定的影响

表4 是否添加活性炭对土壤有效磷测定的影响

表5 提取温度对土壤有效磷测定的影响

表6 显色时间对土壤有效磷测定的影响

3 结论与讨论

中性和石灰性土壤有效磷含量的测定要保证测定数据的准确性。首先，磷标准曲线的正确标定绘制至关重要，直接关系到有效磷测定结果的可靠性。其次，要保证碳酸氢钠浸提剂的pH 值在8.5。整个提取过程中，要保证震荡提取的温度在25℃±1。另外，显色时间必须控制在30 min。除此之外，添加钼锑抗显色液时会生成大量气泡，加液时应注意边摇边加液，尽量使气泡排除，避免在比色时因读数不稳定而影响结果的准确度。

LY/T 1232-2015《森林土壤磷的测定》注明要添加活性炭以吸附消除提取液中的颜色干扰，但此操作步骤烦琐，还会带来二次污染，且本研究表明活性炭的添加与否对土壤有效磷测定的结果影响不大，因此实际检测中常省略这一步骤。有研究表明在880 nm 波长下测定的有效磷效果更好[6]，因此实验室有效磷检测中推荐使用880 nm 波长进行测定。