肿节风SCAR 分子标记克隆与验证

罗 育 黄春喜 蔡丹昭 贺菽嘉 朱 丹

（1.广西医科大学基础医学院， 广西 南宁530021； 2.广西医科大学第一附属医院药学部， 广西 南宁530021； 3.广西医科大学药学院， 广西 南宁530021）

肿节风为金粟兰科草珊瑚属植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，又名九节茶、草珊瑚、九接风等，2015 年版《中国药典》 收载其作为法定药材［1］。肿节风为常用中药，其浸膏及以肿节风作为原料的中成药如肿节风片、血康口服液、万通炎康片也收载入2015 年版《中国药典》［1］；肿节风注射液、新癀片、三蛇胆川贝膏及糖浆则收载入部颁药品标准中［2］。肿节风作为我国传统中药材，对其相关研究主要集中在化学成分、药理活性和临床应用等方面［3⁃5］。现代药理研究表明［6⁃7］，肿节风具有抗菌、抗辐射、抗肿瘤、促进骨折愈合及镇痛等多种药理作用，尤其在治疗肿瘤（胰腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食道癌等）方面具有显著效果［8⁃9］，且具有较好的安全性［10］。

由于肿节风需求量较大，市场上出现了鸡爪兰、金粟兰、及己等与肿节风功效不尽相同的混淆品，已影响肿节风的医疗用途，降低了其药用价值。目前，对中药材鉴别的方法主要有理化鉴别、性状鉴别和显微鉴别［11⁃14］，若通过理化和性状进行鉴别，其优点是方法较可靠，但缺点是比较费时耗力，而若采用显微结构进行鉴别，其局限性较大，原因是该方法要求实验人员有较高的鉴别能力，还要有合理的鉴别依据。相比而言，分子鉴别法鉴别中药材，具有准确性高，其技术经培训后实验人员容易掌握，经验性少，且省时省力的优点。

目前，应用分子鉴别法从基因水平对中药材进行鉴定已有报道，常用的技术主要包括DNA 条形码技术、DNA序列分析技术以及RAPD 技术等［15⁃19］。其中，DNA 条形码技术是目前影响较大、应用较广泛的DNA 鉴定技术，主要利用种间基因序列差异来进行物种鉴定［20］，但目前尚未有一致的植物DNA 条形码标准片段，也甚少应用于对肿节风进行鉴定，因此需要筛选针对肿节风基因组的特异条形码并标准化，最终是否适用于肿节风有待实验验证，这将是本课题组下一步考虑的研究。RAPD 技术是一种有助于研究新发现或改良物种遗传多样性的技术，也经常用于药用植物或中草药鉴定［21⁃25］，但准确性低，而如果通过RAPD技术获得SCAR 分子标记，可以提高特异性和稳定性，虽然有时可能找不到特异的SCAR 分子标记，且需要大量的样本数予以支持，但因所获得的SCAR 分子标记可靠且易于使用，仅需PCR 和凝胶电泳便可以从电泳图上直观地反映鉴定结果，已被用于中草药与其混淆品的区分，是鉴定中草药的重要分子工具［26］。

本研究拟在分子水平上应用RAPD 技术及SCAR 分子鉴定标记对肿节风进行鉴别，以期找到能够鉴别并区分其混淆品的特异引物，从理论上提供鉴定肿节风的新思路，并为鉴定肿节风及区分混淆品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 9 种肿节风和3 种同科混淆品鸡爪兰、及己与金粟兰来自广西药用植物园、广西融水、融安及福建三明等地区，由广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为正品，具体见表1，-20 ℃条件下贮藏于广西医科大学103 馆2 楼综合实验室内。

表1 不同来源肿节风及其部分同科植物基因组DNA 纯度与浓度

1.2 方法

1.2.1 肿节风基因组DNA 提取 采用课题组前期改良CTAB 法［27］提取肿节风基因组DNA。选取适量细嫩叶片，液氮中研碎并分装至EP 管中。加入1.5×CTAB 及β⁃巯基乙醇，混匀后，65 ℃恒温反应30 min，12 000 r／min 离心10 min。将上层溶液吸取至另一EP 管中，加等体积氯仿／异戊醇（24 ∶1），混匀后12 000 r／min 离心10 min，吸取至另一EP 管中，加1／10 体积1×CTAB 和等体积的氯仿／异戊醇（24 ∶1），混匀后同条件离心10 min，吸取至另一EP管中，加等体积1×CTAB，混匀后65 ℃恒温反应30 min，同条件离心10 min，去除溶液留沉淀，加NaCl 溶解，同条件离心10 min。将溶液吸取至合适的离心管中，加2.5 倍体积无水乙醇，混匀后-20 ℃静置15 min，同条件离心5 min，去除溶液留沉淀，70% 乙醇漂洗，同条件离心10 min，去除溶液，挥干管中残液后加适量超纯水，即得DNA 溶液，于-20 ℃下保存。

1.2.2 肿节风基因组DNA 质量检测 取适量DNA 提取液，上样于1% 琼脂糖凝胶，电泳缓冲液1×TAE，电压100 V，电泳15 min，凝胶成像系统观察并拍照。采用Quawell 3000 分析仪，直接读取其A260／A280及浓度。

1.2.3 肿节风基因组DNA 进行RAPD 扩增［28］根据植物基因组DNA 特征，由Takara 公司提供的45 条随机引物进行单一引物PCR 反应，反应体系包括10×缓冲液、Mg2＋、dNTPs、胎牛血清蛋白、单一引物、Templates、rTaqDNA 聚合酶、超纯水，反应程序为94 ℃预变性；94 ℃变性，36 ℃退火，72 ℃延伸，进行35 个循环；最后补充延伸。产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照电泳结果。

1.2.4 肿节风SCAR 分子标记胶回收 用刀片将胶块中的目的条带切下，放置于已灭菌的1.5 mL 离心管中，称定质量。按天根DNA 纯化回收试剂盒说明书进行操作，回收产物通过琼脂糖凝电泳进行检测。

1.2.5 肿节风SCAR 分子标记的克隆、鉴定及测序 按照pEASY⁃T1 Cloning Kit（TransGen Biotech）的说明书进行连接反应，取3 μL 胶回收产物、1 μL 灭菌超纯水、1 μLpEASY⁃T1，25 ℃保温10 min。在上述连接产物中加入感受态细胞，冰上放置30 min，42 ℃水浴45 s，冰上放置2 min，加入细菌培养基，摇床中复苏1 h，涂于平板上，37 ℃培养14～16 h，采用α⁃互补筛选携带重组质粒的细菌。

将重组菌落制成重组菌液，进行PCR 扩增，反应体系与程序同“1.2.3” 项。产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照电泳结果。

经α⁃互补筛选及PCR 鉴定后，取阳性重组菌液置于灭菌离心管中，做好标记并用封口胶密封，送往武汉金开瑞生物工程有限公司进行双向测序。

1.2.6 肿节风鉴定特异性引物设计 利用Vector NTI 软件对测序进行比对，确定4 种不同产地肿节风分子标记的同源序列，肿节风样本分别是广西药用植物园3～4 年栽培品、福建三明5 年栽培品、广西融水4 年栽培品，按照引物设计原则［29］，使用Primer Premier 5.0 软件获得评分高的引物，交由公司合成。

1.2.7 肿节风SCAR 分子标记特异性引物验证 以表1 中9 种肿节风及鸡爪兰、及己与金粟兰等3 种同科易混淆植物基因组DNA 为模板，使用自行设计引物进行PCR 反应，引物序列分别为S41⁃正向，5′⁃ATTTCCCATCCATCGTCG⁃3′；S41⁃反向，5′⁃CCTCCTCTTCCTGCTCCA⁃3′，反应体 系包括10×缓冲液、Mg2＋、dNTPs、引物、Templates、rTaq DNA 聚合酶、超纯水，反应程序为94 ℃预变性；94 ℃变性，53.8 ℃退火，72 ℃延伸，进行30 个循环；最后补充延伸。产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照电泳结果。

2 结果

2.1 肿节风基因组DNA 提取与质量检测 不同来源的肿节风基因组DNA 电泳结果见图1。由此可知，9 种肿节风及3 种同科易混淆植物基因组DNA 条带清晰明亮，表明提取获得的基因组DNA 纯度较高，而且所含杂质较少，DNA分子完整。核酸蛋白分析仪测定肿节风基因组DNA 的相关数据见表1，显示所有样品基因组DNA 的OD260／OD280值均在1.7～2.0 之间，质量浓度在100～550 ng／μL 之间，表明提取到的基因组DNA 纯度较高，质量较好，可作为后续PCR 扩增的模板。

图1 不同来源肿节风及部分同科植物基因组DNA电泳结果

2.2 肿节风基因组DNA 进行RAPD 扩增 从S41号随机引物扩增的结果中获得SCAR 片段，见图2，显示4 种不同产地的肿节风样本RAPD 扩增后出现一致片段（1 000～2 000 bp），重复扩增均有相同的结果。因其片段大小适中，故可以筛选作为SCAR 分子标记。

图2 4 种不同产地肿节风RAPD 扩增结果

2.3 菌液PCR 鉴定 α⁃互补筛选出阳性克隆菌落后，PCR扩增阳性克隆菌落进行鉴定，见图3。由此可知，在1 000～2 000 bp 之间均出现了扩增条带，且是唯一的条带，大小与图2 一致，清晰明亮，表明S41引物扩增获得的SCAR 分子标记已成功插入pEASY⁃T载体中，克隆完成。

2.4 特异性引物鉴定 采用测序合并Vector NTI 软件分析SCAR 分子鉴定标记的碱基序列，长度为1 352 bp（GenBank 登记号为MN244913），此序列作为模板设计出鉴别引物，扩增9 种不同产地肿节风及3 种同科混淆品鸡爪兰、及己与金粟兰等基因组DNA，见图4。由此可知，9 种肿节风均出现有唯一条带（大小约为500 bp），并与预期扩增长度相符；3 种同科混淆品没有扩增条带，因为该引物是从肿节风基因组DNA 的碱基序列中获得，也说明其属于肿节风与同科植物的鉴别引物。同时，获得了一种新的可进行肿节风鉴别的SCAR 分子标记。

图3 菌液PCR 扩增结果

图4 9 种不同产地肿节风及3 种同科混淆品特异引物扩增

3 讨论

中草药等药用植物因其自身次生代谢物较复杂，提取基因组DNA 相对较为困难，若其中的次生代谢物不能有效去除，必将会影响到后续的PCR 扩增；本研究前期使用试剂盒提取肿节风基因组DNA，虽电泳检测时能看到完整的DNA 条带，但其A260／A280比值较差，均不在1.7～2.0 范围，后续的PCR 扩增也得不到稳定的条带。鉴于此，本研究选择了CTAB 法并加以改良，最终获得完整、高质量的肿节风及其他科植物基因组DNA，并能用于后续的PCR 扩增。

本研究在解决了基因组DNA 质量的基础上，通过随机引物获得肿节风RAPD 标记，克隆并筛选转化为SCAR 标记，与GenBank 上其他物种植物基因组DNA 序列进行比对，显示同源性较低，表明其属于肿节风基因组DNA 中的特有序列；以此SCAR 标记为模板设计鉴别引物，PCR 扩增结果显示对9 种不同产地肿节风样本的DNA 具有特异性，而在其他同科植物的DNA 中没有PCR 扩增结果，表明筛选到了可用于肿节风鉴别的特异性SCAR 分子标记，因此结合RAPD 和SCAR2 种分子标记技术，以期建立一种可以对肿节风与其混淆品鉴别的方法，为药用植物以及其他植物物种的遗传特性与鉴别提供参考。