石灰氮与生物菌剂配施对烟草根际微生物群落及防控青枯病的影响

刘高峰，张明宇，黄光辉，赵成坤，李小龙，李秋英，王岩

(1.南平市烟草公司邵武分公司，福建 邵武 354000;2.郑州大学化工与能源学院，河南 郑州 450001)

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种具有严重危害的细菌性土传病害，在中国南方烟区普遍发生[1]。一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量造成极大影响，成为不少地区烟叶生产发展的制约因素[2]。烟草青枯病的发生、流行和危害是诸多因素综合作用的结果，以往对烟草青枯病的研究和防控主要集中在抗性品种选育、化学药剂防控及改善栽培管理等方面[3-5]。虽然各种防控措施均能起到一定效果，但这些防控措施也存在着选育周期长、环境污染、轮作受土地资源限制等诸多问题[6]。目前，生物防控土传病害主要是通过施用拮抗菌或生物有机肥等措施调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性，从而抑制土传病害的发生[7]。石灰氮是一种具有补充Ca，Mg等中量元素、改良土壤和土壤杀菌等多种功效的氮素肥料[8]。石灰氮在土壤中缓慢水解生成氢氧化钙和氰胺，氰胺对土壤微生物具有较强的杀灭作用，并逐渐水解形成尿素或氨直接被植物吸收[9]。以往的研究表明，施用石灰氮能有效改善土壤理化性状和防治土传病害[10]。但石灰氮施用对土壤微生物群落结构等产生的影响方面研究较少。此外，石灰氮在土壤中的灭杀作用是无选择的，会使消毒后的土壤形成“生物真空”。因此，施用石灰氮对土壤消毒后如不及时填补这一“生物真空”，常会因农事操作不当重新将病原菌带入土壤，并且由于此时的土壤失去了生物间的相互制约，被带入的病原菌常会爆发式增长，并导致更加严重的病害发生，所以，土壤消毒后及时增加土壤微生物数量和种类，形成有大量有益微生物存在的微生态环境，则是保持土壤消毒效果和防止病害复发的最佳方法。为此，本试验将石灰氮与生物菌剂配合施用于烟田，旨在通过烟株移栽前施用石灰氮杀灭烟田土壤中的病原菌，在烟株团棵期施用生物菌剂，以期改变烟株根际土壤微生物群落结构调节土壤微生态，实现防控烟草青枯病的目的。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2019年2—7月在福建省邵武市沿山镇烟草基地进行。邵武属于中亚热带季风气候区，日照充足，雨量充沛，常年平均降雨量1 800 mm，年平均气温18 ℃，试验地点海拔200～250 m。试验期间平均气温28.5 ℃。

1.2 试验材料

供试烤烟品种为K 326，试验地前茬作物为水稻。供试烟田在移栽前以条沟方式施用牛粪1 500 kg·hm-2，钙镁磷肥450 kg·hm-2，移栽时施烟叶专用肥465 kg·hm-2(m(N)∶m(P)∶m(K)=12.5∶8∶22.5)，团棵期追施硝酸钾375 kg·hm-2，旺长期硫酸钾270 kg·hm-2。烟田土壤质地为沙质壤土，土壤pH值为5.3，有机质含量为22.9 g·kg-1,碱解氮含量为124.7 mg·kg-1，速效钾含量为201.1 mg·kg-1，有效磷含量为215.6 mg·kg-1。

1.3 试验处理

试验共分为3个处理，每个处理小区面积为666.7 m2。T1为空白处理，按照当地常规施肥与管理，即只施烟叶专用肥、化肥、有机肥；T2在T1基础上于移栽前15 d首次样品采集后施用石灰氮675 kg·hm-2(施入的氮量完全替代烟叶专用肥中的氮素)；T3在T2基础上于团棵期样品采集后施用生物菌剂45 kg·hm-2(拮抗菌选用解淀粉芽孢杆菌B1619，含活菌数≥109·g-1)。试验用石灰氮为灰白色粉末，氮素含量为20%，CaO含量为 35%，pH值为11.5。该肥料在土壤中养分释放相对缓慢，因而肥效高。

分别在移栽前(编号YZ)、团棵期(编号TK)、旺长期(编号WZ)和成熟期(编号CS)4个时期采取烟草根际土壤进行测定，每个处理3次重复。采用S型五点取样法(不少于5株)采取烟株根际土壤，取样时首先去除烟株根部表层土壤，以烟株茎部为中心直径10 cm左右、深10 cm左右处的土壤进行取样。取样后用密封袋低温封存，用15 mL离心管装满，送往上海美吉生物医药科技有限公司对微生物进行基因测序。

1.4 测定内容及方法

1.4.1 病情测定 为了评估试验处理对烟草青枯病的防治效果，在烟株移栽后每隔10 d记载发病情况，计算青枯病的发病率、病情指数和防控率。青枯病病情指数的分级调查按照《GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法》进行。

发病率=(发病株数 / 总株数)×100%；

病情指数=(∑各级病株数或叶数×该病级值)/ (调查总株数或叶数×最高级值) ×100%；

防控效果= (对照病情指数-处理病情指数)/ 对照病情指数×100 %

1.4.2 微生物基因测序 土壤微生物基因测序采用第2代高通量测序技术，对烟株不同生育时期的土壤样本进行细菌(16 S rDNA)和真菌(18 S rDNA)序列检测。DNA 抽提及PCR扩增、Illumina Miseq 测序、数据处理等方法参见陈乾锦等[11]的方法。

1.5 数据计算与统计分析

微生物数量采用Excel 2010进行数据处理，显著性分析采用SPSS Statistics 20.0。测序数据在上海美吉生物医药科技有限公司提供的I-Sanger生物信息分析云平台进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 石灰氮与生物菌剂对土壤微生物群落的影响

2.1.1 石灰氮与生物菌剂对土壤微生物群落组成的影响 如图1-a所示，对细菌门水平上相对丰度排名前10的物种进行Heatmap分析。如果将相对丰度>10 %的细菌划分为优势类群，则样本中共有4种优势菌种，其相对丰度占样本总量的80 %以上。对优势类群在各个时期进行分析的结果表明，酸杆菌门(Acidobacteria)在团棵期T1，T2，T3中的相对丰度分别为8.9%，12.6%，10.4%，进入旺长期后相对丰度分别为13.9%，10.5%，11.9%，进入成熟期后分别为7.5%，10.8%，8.5%；变形菌门(Proteobacteria)在旺长期T1，T2，T3中的相对丰度分别为29.1%，33.8%，30.0%，进入成熟期后分别为27.2%，25.0%，29.4%；放线菌门(Actinobacteria)仅成熟期在处理与对照中表现出差异，T1，T2，T3中的相对丰度分别为30.6%，24.6%，27.2%；绿弯菌门(Chloroflexi)在旺长期的T1，T2，T3中的相对丰度分别为22.2%，17.3%，22.4%，进入成熟期后分别为18.0%，21.8%，18.3%。对于非优势菌种而言，厚壁菌门(Firmicutes)在旺长期T1，T2，T3中分别为4.1%，6.1%，5.4%；芽孢杆菌门(Gemmatimonadetes)在团棵期T1，T2，T3中分别为2.6%，1.9%，2.0%；硝化螺旋菌门(Nitrospirae)在团棵期的对照组与处理组中表现出明显差异，T1，T2，T3中的相对丰度分别为1.2%，1.6%，1.7%；糖化细菌门(Saccharibacteria)在整个烟株生长期内均表现为处理组明显低于对照组。这表明移栽前施用石灰氮，在团棵期会增加烟株根际土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度，而减少了芽孢杆菌门(Gemmatimonadetes)、糖化细菌门(Saccharibacteria)的相对丰度。团棵期生物菌剂的施用，则改变了旺长期与成熟期烟株根际土壤中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)等的相对丰度。

如图1-b所示，在真菌门水平上共有2种优势菌种。子囊菌门(Ascomycota)在团棵期T1，T2，T3中的相对丰度分别为62.0%，80.3%，76.9%，旺长期相对丰度分别为75.8%，81.9%，79.5%，成熟期相对丰度分别为81.8%，89.2%，88.5%；担子菌门(Basidiomycota)在团棵期T1，T2，T3中的相对丰度分别为8.6%，10.3%，14.7%，成熟期相对丰度分别为8.9%，6.8%，6.8%。对于非优势菌种而言，unclassified_d__Eukaryota在整个烟株生长期内均表现为处理组明显低于对照组，在团棵期T1，T2，T3中的相对丰度分别为12.5%，1.4%，1.3%，旺长期分别为3.5%，0.9%，0.8%，成熟期分别为3.6%，0.6%，0.6%。这表明施用石灰氮可以在旺长期增加真菌中优势菌种的相对丰度，而在整个烟株生长时期内抑制unclassified_d__Eukaryota的生长。

2.1.2 石灰氮与生物菌剂对烟株根际土壤微生物Alpha多样性的影响 环境中微生物的多样性分析可以反映微生物群落的丰度和匀质性。Cove-rage指数是指各样本文库的覆盖率，其数值越高说明样本中序列被测出的概率越高，样本具有代表性。本试验中各样本细菌及真菌的Coverage值都在93%以上，表明本次测序结果能够代表样本中微生物的真实情况。各个时期及处理的Alpha多样性如表1所示。对于细菌来说，团棵期的处理中无论是Sobs指数、Shannon指数，还是Ace指数均明显高于对照组。表明移栽前施用石灰氮在团棵期能增加烟株根际土壤细菌的物种数量，群落多样性及群落丰度。旺长期的处理各指数均低于对照组，且T2低于T3。成熟期在T1，T2中Sobs指数分别为2 964，3 158(P<5%)，Shannon指数、Ace指数均表现为处理组明显高于对照组。真菌各指数在成熟期之前均未表现出明显差别，成熟期Sobs指数在T1，T2，T3中分别为341，285，286(P<5%)，Shannon指数在T1，T2，T3中分别为3.16，2.51，2.94，Ace指数在T1，T2，T3中分别为417，359，340。这表明，施用石灰氮在成熟期能减少烟株根际土壤真菌的物种数量和多样性。

注：a.细菌门；b.真菌门。横坐标为样本名(或分组名)，纵坐标为物种名，通过色块颜色梯度来展示样本中不同物种的丰度变化情况。图中右侧为颜色梯度代表的数值。Note:a.Bacteria phylum;b.Fungi phylum.The abscissa is the sample name (or group name),and the ordinate is the species name.The change of abundance of different species in the sample is shown by the color gradient of the color block.The value represented by the color gradient is on the right of the figure.图1 烟株根际土壤微生物群落结构在门水平上的Heatmap图Fig.1 Heatmap of microbial community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at phylum level

表1 烟株根际土壤微生物Alpha多样性变化Table 1 Changes of microbial alpha diversity in rhizosphere soil of tobacco plants

续表1 Contuning table 1

2.1.3 石灰氮与生物菌剂对烟株根际土壤微生物Beta多样性的影响 PCA 主成分分析能够反映不同调控措施下烟株根际土壤微生物群落的变化情况。图2a为细菌属水平上的PCA图，团棵期T1，T2，T3中群落组成差异并不明显，旺长期T1与T2，T3之间群落组成出现明显差异，而T2，T3群落组成差异不明显，成熟期不仅T1与T2，T3之间群落组成差异更大，而且T2与T3群落组成开始表现出差异。这表明施用石灰氮对烟株根际土壤细菌群落的影响在旺长期开始表现，而混合施用生物菌剂则是成熟期才表现出差异。图2b为真菌属水平PCA图，团棵期T1与T2，T3的群落组成就开始表现出差异，旺长期其差异更加明显，而施用生物菌剂的处理T3与T2相比群落组成差异并不明显。这表明施用石灰氮对烟株根际土壤中细菌、真菌的群落结构均具有明显影响，而施用生物菌剂对烟株根际土壤中细菌群落结构的影响更大。

注：a.细菌属水平；b.真菌属水平。Note:a.Becteria genus level;b.Fungi genus level.图2 烟株根际土壤微生物PCA图Fig.2 PCA diagram of soil microorganisms in rhizosphere of tobacco plant

2.1.4 石灰氮与生物菌剂对烟株根际土壤中青枯病病原菌的影响 对烟株不同生长时期及不同处理中烟株根际土壤中病原菌进行检验，结果如表2所示。移栽前植烟土壤中病原菌丰度为0.003 2%，团棵期T1中病原菌几乎没有，T2，T3中含量均为0.004 7%，这可能是由于石灰氮采用条施后起垄的方式导致石灰氮与土壤混合不均匀，从而影响了石灰氮杀灭病原菌的作用。进入烟株生长的旺长期后石灰氮处理中的病原菌含量仍高于对照，T2高于T3。但是进入成熟期后青枯病病原菌在T1，T2，T3中的丰度分别为0.029 9%，0.014 2%，0.009 5%，对照中病原菌丰度显著高于处理组。这表明石灰氮及生物菌剂的施用在烟草成熟期后才表现出显著降低烟株根际土壤中病原菌相对丰度的作用。比较而言，石灰氮与生物菌剂配合施用(T3)对降低病原菌丰度的效果最好。

表2 烟株根际土壤中病原菌丰度Table 2 Relative abundance of pathogenic bacteria in rhizosphere soil of tobacco plant

2.2 施用石灰氮与生物菌剂对青枯病发病率的影响

试验田成熟期青枯病的发病率如表5所示，处理组中发病率明显低于对照组。这可能是由于处理组在石灰氮施加后，烟株根际土壤中功能菌含量增多，微生物区系结构改变，土壤肥力增加的结果。而在T2中发病率为43.2 %，防控效果为45.3 %，T3中发病率为36.7 %，防控效果为58.8 %，表明施用石灰氮能显著降低烟草青枯病的发病率，而石灰氮与生物菌剂复合施用效果最好。这可能是生物菌剂的施用进一步降低了烟株根际土壤中病原菌的相对丰度，并且抑制了其他有害菌增殖的结果。

表3 施用石灰氮及生物菌剂对烟草青枯病的防控效果Table 3 Control effect of application of lime nitrogen and biological fertilizer on tobacco bacterial wilt

3 结论与讨论

移栽前施用石灰氮显著改变了烟株根际土壤微生物的群落结构，团棵期优势菌种中变形菌门(Proteoacteria)，绿弯菌门(Chloroflexi)，酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度增加，放线菌门(Actinobacteria)相对丰度降低，非优势菌种硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度增多，糖化细菌门(Saccharibacteria)的相对丰度显著降低(P<5%)。硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度增多可能与石灰氮的分解有关，硝化螺旋菌属可以将硝化菌氧化土壤氨生成的亚硝酸继续氧化成硝酸盐，而硝酸盐是土壤中作物易吸收的氮源形式，因此，土壤中硝化螺旋菌的增加可以间接地增加土壤肥力[12]。推测土壤肥力的增加可能是团棵期烟株根际土壤微生物群落中物种数目，群落多样性及群落丰度升高的原因。有研究结果显示，烟草发病土壤中糖化细菌门(Saccharibacteria)的丰度较高[13]，而团棵期糖化细菌门(Saccharibacteria)相对丰度的显著降低。这可能是由于石灰氮遇水分解后所生成的氰胺对土壤中的真菌、细菌等有害生物具有广谱性的杀灭作用，而起垄后覆盖地膜，在日光照射下可以提高土壤温度，经过热力灭菌作用，达到杀死土壤有害生物的目的[14]。但病原菌丰度的差异性检验显示，团棵期的处理组中病原菌丰度反而高于对照。这可能是由于石灰氮采用条施后起垄的方式导致石灰氮与土壤混合不均匀，从而影响了石灰氮杀灭病原菌的作用。研究表明，土壤微生物种群和数量影响青枯菌数量和青枯病的发生，通过调节土壤微生态可起到抑制土传病害的目的[15]。PCA分析显示，移栽前石灰氮的施用使烟株根际土壤微生物群落在旺长期的对照与处理组中产生明显差异，进入成熟期差异进一步增大，而团棵期生物菌剂的施用使成熟期烟株根际土壤微生物群落在处理T2，T3中产生差异，烟株根际土壤微生物群落结构的差异可能是发病率产生差别的原因。

旺长期是烟株根际土壤微生物群落变化最明显的时期。旺长期根系分泌物增多,土壤内各种酶活性增大，微生物活性增加[16]。此时期的烟株根际土壤中对照与处理组的Alpha多样性并没有显著差异，但进入成熟期后，处理组烟株根际土壤中的物种数量显著高于对照(P<5%)，群落多样性及群落丰度也明显高于对照，且T3的群落丰度也略高于T2。此时病原菌丰度的差异性检验显示，对照组的病原菌丰度明显高于处理组，处理T2，T3中病原菌丰度与对照相比分别降低53%和70%。这表明施用石灰氮及生物菌剂可以增加成熟期的烟株根际土壤的物种种类、物种多样性及丰富度。有研究显示，高水平的微生物多样性能够抑制土传病害的发生，提高土壤质量[17-19]。这可能是由于高微生物多样性可以在一定程度上抑制青枯菌的繁殖，从而达到防控青枯病的目的。