HPLC-DAD法快速筛查农药制剂中92种非法添加成分

乔海清，王晓滨，白一彤，辛海燕，王 婷，李建兵*

(1.青岛市产品质量监督检验研究院，山东 青岛 266101；2.国家海洋精细化工及其生物制品质量监督检验中心，山东 青岛 266101)

农药是一类重要的农业生产资料，主要用于防治有害生物，保证农业增产丰收，提高农产品品质，被广泛应用于农业生产的产前至产后的全过程[1]。近年来，农药产品质量有所提高，但是非法添加隐性成分依旧是农药质量不合格的重点问题，有些不法分子为了牟取利润，在农药产品中添加除标签和说明书标注以外的农药成分，给农药监管带来了严峻挑战[2]。农药中非法添加成分不仅会造成农产品农药残留超标，影响食品安全，危害人身体健康，还会危及生态环境安全，造成农药行业的不良竞争，因此必须采取有效措施对非法添加成分进行有效监管[3～4]。目前检测农药非法添加成分的方法主要有GC-MS，HPLC-MS/MS，UPC-Q-TOF法，但是这些仪器昂贵，使用和维护成本高，而液相色谱基层实验室常配备，更有利于方法的推广[5]。

本文选取了常见的92种非法添加物，建立了HPLC-DAD快速筛查方法，根据保留时间和DAD-UV光谱图数据库对非法添加成分进行分析，并对实际农药产品进行验证。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂 仪器：P680A液相色谱仪配有二极管阵列检测器，戴安；电子天平(AB265-S，0.01 mg)，METTLER TOLEDO；电子天平(ME204，0.1 mg)，METTLER TOLEDO。

试剂：甲醇、乙腈，HPLC级，CNW

标准物质：2,4-滴，阿维菌素，百菌清，倍硫磷，苯醚甲环唑，吡丙醚，吡虫啉，吡蚜酮，吡唑醚菌酯，丙环唑，丙溴磷，溴虫腈，哒螨灵，哒嗪硫磷，敌敌畏，丁硫克百威，丁醚脲，啶虫脒，毒死蜱，二甲戊灵，二嗪磷，伏杀硫磷，氟胺氰菊酯，氟虫腈，氟啶脲，氟硅唑，氟铃脲，氟氯氰菊酯，氟氰戊菊酯，福美双，腐霉利，己唑醇，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，甲胺磷，甲拌磷，甲草胺，甲基毒死蜱，甲基对硫磷，甲基硫菌灵，甲基异柳磷，甲氰菊酯，甲霜灵，腈菌唑，久效磷，抗蚜威，克百威，喹硫磷，喹螨醚，乐果，联苯菊酯，螺螨酯，氯虫苯甲酰胺，氯菊酯，氯氰菊酯，氯噻啉，氯唑磷，马拉硫磷，醚菊酯，嘧菌酯，嘧霉胺，灭多威，灭线磷，灭蝇胺，氰戊菊酯，炔螨特，噻虫啉，噻虫嗪，噻螨酮，噻嗪酮，三氯杀螨醇，三氯杀螨砜，三唑酮，杀螟丹，杀螟硫磷，杀扑磷，霜脲氰，水胺硫磷，特丁硫磷，戊唑醇，烯啶虫胺，烯酰吗啉，辛硫磷，溴氰菊酯，烟嘧磺隆，氧乐果，乙霉威，乙酰甲胺磷，异丙威，茚虫威，蝇毒磷，仲丁威，唑虫酰胺，Dr.Ehrenstorfer。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱条件 Thermo Hypersil Gold C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A：0.1%磷酸溶液，流动相B：甲醇-乙腈(质量比50：50)，流速1.0mL/min，进样量10μL，梯度洗脱程序(表1)。采用二极管阵列检测器，波长扫描范围：190nm～400nm，光谱步进值：1.0 nm，光谱采集模式：全部。

表1 92种非法添加农药分离的梯度洗脱程序

1.2.2 标准溶液的配制 农药单标储备液：准确称取10mg(精确到0.01mg)各农药标准品于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，各农药储备液浓度为1 000mg/L。

农药单标使用液：准确移取100uL单标储备液，用流动相定容于10mL容量瓶中，混匀，现用现配。

农药混标工作液：准确移取不同体积单标储备液，用甲醇定容于10mL容量瓶中，混匀，配制混标溶液。

1.3 样品前处理 本实验针对可湿性粉剂和乳油等常见的农药产品进行样品处理。称取适量样品于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声15min，放冷至室温。加甲醇定容至刻度线，混匀。可湿性粉剂样品需离心过滤后待测，乳油样品直接过滤待测。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的选择 不同制剂农药产品在生产过程中会加入不同的助剂。乳油产品加入有机溶剂和助溶剂如甲醇、乙腈和丙酮等，悬浮剂产品加入分散剂和润湿剂等，可加入甲醇直接超声提取测定。可湿性粉剂产品加入载体，如硅藻土和高岭土等，不溶于甲醇，需提取离心过滤后测定[6]。

2.2 液相色谱条件的选择 本研究采用Thermo Hypersil Gold C18柱进行分析，流动相A为0.1%磷酸溶液，流动相B为甲醇-乙腈(质量比50：50)。甲醇梯度洗脱产生的柱压比乙腈大，但是甲醇更有利于农药成分的保留以及基质杂质的洗脱，从而减少杂质在色谱柱中的保留，延长色谱柱的寿命，在流动相中加入酸可得到更优的峰形和分离效果[6～7]，因此选用0.1%磷酸溶液和甲醇-乙腈体系作为流动相。

多农药的分析需要相对平缓的液相洗脱梯度，减少基质对目标分析物的干扰，并采用大梯度洗脱方式，使各种农药都有较好的分离度[8]，在分析过程中水相起始比例为80%，在28min内缓慢变化到10%，再在15min内变化到80%。

2.3 数据库的建立 在固定色谱条件下，化合物的保留时间是相对固定的。在进行未知物检测时，在同样色谱条件下，未知物的保留时间与已知化合物一致时，则可认为是同一种物质。但该方法需提前使用相同的色谱柱，在相同色谱条件下对已知化合物建立保留时间数据库来提高定性的准确性[9～10]。在1.2.1 液相色谱条件下对农药单标使用液进行测定，得到各农药成分的保留时间(表2)；92种非法添加农药混标的3D色谱图(图1)。

表2 92种农药的保留时间和最大吸收波长

续表

续表

图1 92种非法添加混合标物的3D色谱图

HPLC-DAD法可以分析待测物的紫外光谱信息，根据各农药标准物质的DAD-UV光谱图建立92种非法添加农药的光谱图数据库。从表2可以发现，丁硫克百威和克百威的保留时间非常接近，但是其DAD-UV光谱图有明显差别(图2)。如图2所示甲霜灵和甲氰菊酯的光谱图非常相似，但是其保留时间差别很大(表2)。因此可以预先建立相应的数据库，通过保留时间和DAD光谱图对非法添加农药进行确证[11]。

图2 丁硫克百威、克百威、甲霜灵和甲氰菊酯DAD-UV光谱图

2.4 典型样品测定 对已知含非法添加农药样品按照1.3处理，按照1.2.1液相色谱条件分析，根据保留时间和DAD-UV光谱数据库索引，发现3.2%阿维菌素乳油中含有螺螨酯，25%吡虫啉可湿性粉剂中含有灭多威(图3)。

图3 农药标准物质DAD图和典型性样品DAD光谱图及液相色谱图

3 结论

针对乳油和可湿性粉剂常见农药制剂建立了92种非法添加成分的高效液相色谱-DAD快速筛查法。非法添加成分种类繁多，极性相差很大，采用大梯度洗脱方式进行分析。通过预先建立保留时间和DAD-UV光谱数据库对农药产品中的非法添加成分进行确证，该方法快速、简单、准确，检测成本低，可以用于非法添加成分的快速筛查。