香果树可培养内生真菌的群落结构及功能活性菌株的筛选

张红芳，李小红，何刚，陈晔

九江学院药学与生命科学学院，江西九江 332000

0 前言

香果树(Emmenopterys henryiOliv.)为茜草科植物，是我国特有单种属的珍稀濒危植物[1-2]。由于香果树具有较高的药用、观赏以及潜在应用价值[3]，人们大量砍伐和毁林开荒，破坏了适宜香果树生长的生境，使香果树的数量比若干年前已大量减少，加上香果树种子萌发率低，天然更新能力差，从而导致香果树分布范围逐渐缩减，现只零星分布在一些山坡、山谷溪沟边，几乎濒临灭绝[4]。可见，加强香果树的保育已成为当前迫在眉睫的科学问题。目前，人们已开展了香果树资源分布、化学成分分析、濒危机制、繁殖与栽培管理技术等方面的研究，已取得丰富成果[3，5-8]。然而，对香果树内生真菌多样性的研究鲜见报道。

植物内生真菌作为一类特殊的微生物资源[9]，普遍存在于植物组织内，与宿主植物形成互惠共生体长期共生，其在植物体内生长，具有稳定的生长环境，对宿主植物产生多种有益生物学作用，既可以改变植物生理代谢并增强宿主抗逆性，其代谢作用又可以促进植物的生长发育。研究发现，植物内生真菌与宿主在遗传、生理、代谢等方面相互渗透、同步进化使得它极有可能与宿主交换遗传信息，从而产生相似或相同生理活性的次级代谢产物，是潜在的微生物药物开发资源[10-13]。另外，研究表明内生真菌具有分布广、种类多等特点，而且在植物不同组织器官分离得到的内生真菌的优势菌株对植物具有不同的功能，这可以作为筛选不同功能性菌株的理论依据，可见植物内生真菌是真菌中急待研究开发的宝贵资源[14-16]。

为进一步保护和利用香果树这一濒危植物，本文以香果树为材料，探索其在不同居群地内生真菌的物种多样性、群落组成以及生态分布规律。研究结果将有助于进一步了解不同居群地香果树内生真菌的类群组成和生态分布规律，为探究香果树内生真菌对宿主植物促生作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集处理

2016年10月上旬和2017年2月下旬在江西省九江庐山采样，2017年6月下旬和7月上旬分别于九江庐山、铜鼓县大沩山林场、井冈山市茨坪白银湖、上饶市玉山县三清山 4个居群地进行采样，随机采集香果树(Emmenopterys henryiOliv.)3株健康植株，每株植株分别采集香果树叶20片，枝条20支，根20个，拍照、编号、登记有关基本资料。均放于采集袋中，其中叶子放于低温采集箱中。记录所处地理位置和环境(表1)。将样本带回实验室，4 ℃冰箱保藏，叶在2 d内处理完毕，茎和根在7 d内处理完成。

1.1.2 培养基

(1)分离、纯化和保种为PDA培养基；(2)无机磷培养基用于溶磷菌株筛选[17]；(3)解钾培养基用于解钾菌株筛选[18]；(4)King 培养基[19]。

1.2 内生真菌的分离纯化

采用常规的组织分离法进行内生真菌的分离纯化[20]，将纯化好的菌株保存在本校真菌实验室标本室(JJTU)。

1.3 功能活性菌株的筛选

(1)溶磷真菌筛选: 按溶磷圈方法进行溶磷菌株筛选[21]；(2)解钾真菌筛选: 根据菌株趋向性进行解钾菌株筛选[22]；(3)分泌IAA菌株筛选: 用比色法进行产生IAA的功能活性菌株筛选[19，22-23]。

表1 采集样地基本概况Table 1 Basic general situation of sampling sites

1.4 内生真菌的鉴定

1.4.1 产孢内生真菌的鉴定

根据菌落的颜色、形态、菌丝和产孢结构的形态特征鉴定到属。真菌属的鉴定主要依据 Barnett &Hunter、Dictionary of fungi[24]、Keith Seifer的分类系统和《真菌鉴定手册》[25]，并参考国内外相关期刊发表的文献资料[26-27]。

1.4.2 不产孢内生真菌菌株分子生物学鉴定

将不产孢菌株置于4 ℃恒温冰箱进行低温处理，并检查其产孢情况，产孢后按上述方法进行鉴定。经处理后仍不产孢的菌株，根据菌落的培养特征及微观特征进行形态型的划分合并。通过选取具有代表性的形态型菌株，分别刮取在PDA上培养成熟的菌丝，利用氯化苄法提取DNA[28]。采用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行PCR扩增[29]，获得的扩增产物送往南京思普金生物科技有限公司进行序列测定。测得序列经峰图检查并在NCBI中进行同源性比对[30]。确保序列准确性后，将本研究获得序列和从 GenBank数据库中下载的相关序列利用 MEGA 5.0软件构建序列矩阵并使用MUSCLE软件包进行序列比对[31]，手动调整并借助Gblocks v.0.91b软件删除高变区[32]。利用MrModeltest 2.0软件对待建树序列矩阵进行最适模型选择[33]，采用 RAxML 7.2.8软件基于最大似然法(Maximum Likelihood，ML)进行属级水平的分子系统发育分析[34]，经1000次重复的“non parametric bootsrapping”获得统计学支持(Bootstrap values of the ML tree，BS)[35]。

1.5 数据统计分析

采用分离率(Isolation rate，IR)衡量组织中内生真菌的丰富程度[36-37]；采用分离频率(Isolation frequency，IF)比较判断内生真菌的优势菌群[38]。

采用Shannon-Weiner多样性指数(He)进行内生真菌种群的多样性水平分析。用Pielou均匀度指数分析菌群分布的均匀程度[38]。

采用Jaccard相似性指数(Cj)对内生真菌组成的相似程度进行比较和分析[36]。

2 结果与分析

2.1 香果树内生真菌主要类群组成

从 4个居群地香果树 1980个组织块中分离出757株内生真菌，其中产孢菌株 240株，占总数31.70%，不产孢菌株517株，占总数68.30%。

为明确不产孢真菌的分类地位，本研究通过对不产孢的32组菌株进行rDNA-ITS序列测定，所测得序列在 GenBank中经 Blast搜索核酸数据库(blastn)，比对分析序列同源性，进行分子鉴定。为了更直观表明不产孢真菌的分类地位及其亲缘关系，将32组菌种真菌的rDNA-ITS序列与来自Genbank的同源序列和外群序列进行聚类分析，采用最大似然法以最适模型 GTR+G 构建系统发育树，分支上为Bootstrap(重复1000次)≥50%的靴带值。由图1—13分析可知，32组菌株分别隶属于13个属。

根据形态学特征并结合分子鉴定结果，初步将757株内生真菌划分为Arthopyrenia、Colletotrichum、Phomopsis、Penicillium等40个分类单元，在属的水平以Arthopyrenia、Colletotrichum、Diaporthe为优势菌群，其分离频率分别为 19.42%、15.32%、9.64%(表 2)。

表2 香果树内生真菌的菌群组成Table 2 Composition of endophytic fungi from Emmenopterys henryi

2.2 香果树内生真菌时空分布

2.2.1 不同居群地香果树内生真菌菌群的分布

在同一季节，4个居群地香果树中内生真菌的菌群组成存在着明显差异，在分离频率上表现为三清山＞井冈山＞铜鼓＞庐山的规律，三清山居群地香果树内生真菌出现频率略高于井冈山，分离频率分别为31.18%和30.32%，而铜鼓和庐山的分离频率分别为24.52%、13.98%(表2)。

在各个居群地的优势类群分布存在一定的差异，由表 2可见，庐山以Colletotrichum(15.38%)、Fusarium(13.85%)和Phomopsis(12.31%)为优势菌群，铜鼓以Colletotrichum(21.05%)、Arthopyrenia(20.18%)和Pestalotiopsis(18.42%)为优势菌群，井冈山以Arthopyrenia(29.79%)、Botryosphaeria(8.51%)和Phomopsis(8.51%)为优势菌群，三清山以Colletotrichum(29.66%)、Arthopyrenia(22.76%)和Phomopsis(8.97%)为优势菌群。不难看出，Colletotrichum为庐山、铜鼓，三清山居群地的共同优势菌群；Arthopyrenia为铜鼓、井冈山、三清山居群地的共同优势菌群；Phomopsis为庐山、井冈山、三清山居群地的共同优势菌群。

有些内生真菌类群在不同居群地表现出一定专一性，如Chloridium、Sporotrichum等仅分布在庐山，Rhizoctonia仅在铜鼓分离得到，而Gliocephalis、Scytalidium等仅分布在井冈山，Coremiella、Kramasamuha则仅在三清山分离得到。

2.2.2 香果树不同组织中内生真菌菌群的分布

从分离频率来看，香果树叶、茎和根等不同组织部位内生真菌在数量、种群分布以及优势种群等方面存在较大差异，叶(50.99%)＞根(25.63%)＞茎(23.38%)(表 2)，叶中的内生真菌数量上较为丰富，茎最少；叶的分离频率为最高，茎的分离频率最低，同时，在各个组织部位的优势类群分布也存在一定的差异。除2—3个明显较重要的属外(IF＞10)，分离频率较低(IF＜5)的属构成了香果树内生真菌的主要组成。有些内生真菌类群表现出一定组织专一性，如Baudoinia、Coremiella、Dissoconium等仅分布在叶 中 ；Alysidium、Gliocephalis、Scopulariops、Pseudochaetosphaeronema仅在茎中分离得到；Mucrosporium、Humicola、Fraseriella等仅分布在根中。

2.2.3 不同季节对香果树内生真菌菌群分布的影响

以庐山居群地为对象，分析不同季节对香果树内生真菌菌群分布的影响。从分离频率来看，不同季节香果树内生真菌菌群组成存在较大差异，冬季(41.74%)＞秋季(40.06%)＞夏季(18.21%)(表 2)，在各个季节的优势类群分布也存在一定的差异。冬季以Diaporthe(16.78%)、Mucrosporium(14.77%)为优势菌群，秋季以Colletotrichum(15.38%)、Saccharomyces(12.59%)为优势菌群，夏季以Colletotrichum(15.38%)、Fusarium(13.85%)为优势菌群。

2.3 内生真菌相似性及多样性分析

2.3.1 香果树内生真菌菌群组成的相似性

相似性系数是反映两个不同生境中真菌菌群组成相似程度的重要参数[39]。从相似性性系数可以看出，4个居群地香果树内生真菌相似性较低(表3)，其相似性系数(Cj)在0.29—0.52之间。其中庐山与井冈山(Cj=0.5185)、铜鼓和井冈山(Cj=0.5000)为中等程度相似，而其他居群地两两之间均为中等不相似，Cj在0.25—0.5之间。表明不同居群地香果树内生真菌菌群组成存在一定的差异，这可能与不同居群地的海拔、气候因素及土壤因素有关(表1)。

从表 4可以看出，不同季节香果树内生真菌相似性系数(Cj)在0.46—0.60之间。其中，冬季和秋季(Cj=0.5769)、夏季和秋季(Cj=0.5385)为中等程度相似，冬季和夏季为中等不相似(Cj=0.5000)。

2.3.2 香果树内生真菌菌群组成的多样性

从 Pielou均匀度指数(E)来看，4个居群地香果树组织的内生真菌菌群的均匀度指数在 0.7009—0.8760之间(表5)，说明香果树内生真菌菌群组成在4个居群地分布较均匀。其中，庐山居群地均匀度指数为 0.8760，稍高于井冈山(0.8371)，三清山居群地均匀度指数为 0.7009，略低于铜鼓(0.7861)。从Shannon-Wiener多样性指数(He)来看，香果树内生真菌在4个居群地的多样性指数差异不明显。庐山最高，He为 2.6243，三清山的最低，He为 2.0997，从而体现出4个居群地的香果树内生真菌菌群组成相对较稳定。从 Berger-Parker优势度指数来看，庐山最高，为 0.9075，三清山的最低，为 0.8304。从Margalef丰富度指数(R)来看，铜鼓和井冈山最高，为 3.0169，三清山最低，为 2.1118。可以看出，不同居群地的各项指数都存在一定的差异。例如，铜鼓的多样性指数和均匀度指数都偏低，但其丰富度指数最高；庐山的优势度指数、多样性指数和均匀度指数都是最高，但丰富度指数却低于铜鼓和井冈山。然而三清山的各项指数都是最低的，这可能与其植被长期经风化侵蚀和重力的崩解作用而不利于内生真菌的寄生有关(表1)。

表3 不同地点香果树内生真菌相似性系数Table 3 Similarity coefficients of endophytic fungi from Emmenopterys henryi in different sampling locations

表4 不同季节香果树内生真菌相似性系数Table 4 Similarity coefficients of endophytic fungi from Emmenopterys henryi in different seasons

由表 5可知，香果树内生真菌菌群的 Shannon-Wiener 多样性指数(He)、Margalef 丰富度指数(R)、Berger-Parker优势度指数(D)和Pielou-evenness均匀度指数(E)在香果树不同组织部位之间的变化趋势基本一致，即: 根＞茎＞叶，由此可推断，尽管从香果树根中分离的内生真菌菌株数量较少，分离频率低，但其多样性却较其他两个部位的内生真菌菌群更高；相反，尽管从香果树叶中分离的内生真菌菌株数量较多，分离频率高，但其多样性却较其他两个部位的内生真菌菌群更低。

2.4 功能活性菌株的筛选结果

对分离获得的757株香果树内生真菌菌株进行溶磷、解钾活性、分泌IAA的功能活性筛选(图14)，获得82株具有溶磷效果，36株具有解钾活性，13株具有分泌IAA活性菌株，9株既有溶磷又有解钾活性，为进一步探索香果树植物内生真菌对宿主植物促生效应提供依据。

表5 不同居群地香果树内生真菌多样性指数Table 5 Diversity indices of endophytic fungi from Emmenopterys henryi in different sampling locations

图1 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG4的系统发育树Figure 1 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG4 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图2 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG28的系统发育树Figure 2 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG28 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图3 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG16的系统发育树Figure 3 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG16 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图4 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG10和LXD16的系统发育树Figure 4 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG4 and LXD16 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图5 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG1和XG3的系统发育树Figure 5 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG1 and XG3 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图6 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG18的系统发育树Figure 6 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG18 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图7 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG15的系统发育树Figure 7 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG15 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图8 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG5的系统发育树Figure 8 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG5 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图9 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG2等的系统发育树Figure 9 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG2 etal. isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图10 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG17和XG20的系统发育树Figure 10 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG17 and XG20 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图11 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG12等的系统发育树Figure 11 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG12 etal. isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图12 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG7和XG11的系统发育树Figure 12 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG7 and XG11 isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图13 基于ITS基因序列构建的香果树不产孢菌株XG9等的系统发育树Figure 13 Molecular phylogenetic tree of sterile strains XG9 etal. isolated from Emmenopterys henryi inferred from ITS gene sequences

图14 部分菌株溶磷、解钾、产IAA活性的筛选图Figure 14 Screening pictures of some strains for phosphorus-soluble, potassium-soluble and IAA-secreting activities

3 讨论

本研究于2016年10月上旬和2017年2月下旬在江西省九江庐山采样，2017年6月下旬和7月上旬分别从江西省九江庐山、铜鼓县大沩山林场、井冈山市茨坪白银湖、上饶市玉山县三清山等4个居群地采集的香果树的1980个组织块中分离出757株内生真菌，其中产孢的菌株240株，占总数31.70%，不产孢菌株 517株，占总数 68.30%，这与之前对其他植物内生真菌的许多同类研究的结果相似[39-43]，其原因可能是内生真菌与宿主在长期协同进化中形成的适应关系使得内生真菌不仅在宿主体内不产子实体及孢子[42]，而且在体外培养时也已不易产生子实体[38]。

不同居群地的优势类群分布存在的差异，可能与其所处地理位置的气候因素、土壤因素和香果树组织生理状况以及化学组成的明显变化等因素相关(见表1)。从气候因素来看，4个居群地的海拔、年平均气温、降雨量和光照等均存在差异。温度、湿度、光照等气候条件的差异，一方面影响内生真菌对宿主植物的感染、定殖和生长[44]，从而使得同一植物内生真菌的分布在不同居群地发生明显变化[45]；另一方面导致植物组织的生理状况以及化学组成的明显变化，从而影响香果树内生真菌的类群和分布。从分离频率来看，三清山和井冈山明显高于庐山和铜鼓，原因除了气候因素之外，可能还与人类活动有关，三清山和井冈山采样点都处于人迹罕至的森林里，受人类活动的影响较少，同时林下植被未受到破坏，为真菌生长提供有利条件，有利真菌的浸染，而庐山采样地三宝树是庐山主要景点之一，人流量大，人类干扰多，林下主要一些草本类植物，经常被清理，不利真菌生长，人类活动对真菌浸染宿主植物具体机制有待探究。

庐山居群地不同季节的分离频率呈现秋冬季节明显高于夏季的趋势，这种差异可能与季节的气候因素(如温度、湿度、光照等)、土壤因素和香果树组织生理状况以及化学组成的明显变化等因素有关。主要归因于气候因素和人类活动。庐山属于亚热带季风气候，夏短冬长，7月份采样正是游客多、人流量大的时候，并且夏季温度高、空气干燥，不利于内生真菌的寄生；而秋季采样在10月初，经过9中上旬的雨季，雨量充沛、温度适宜，正好是真菌爆发性生长的高峰期，有利于真菌的浸染宿主。冬季采样是 2月底，经过秋季真菌的孢子或菌丝对宿主的浸染，真菌孢子和菌丝在宿主体内的生长，与宿主之间形成协同作用。

不同组织部位内生真菌在数量、种群分布以及优势种群等方面存在较大差异，以叶的分离频率为最高，茎的分离频率最低。这可能与内生真菌的来源及其萌发、生长和扩展有关[46]。植物茎中的韧皮纤维质地坚韧，为韧皮部中担负机械支持功能的成分，可能不利于内生真菌的寄生；而叶片具有气孔，能够很好的与空气接触，可以接受空气中大量真菌孢子，利于内生真菌的寄生[20]。也可能与地区土壤环境有关，若土壤贫瘠，有些真菌难以在这种环境中生存，故侵入香果树根、茎内生真菌数量较少。具体影响内生真菌在香果树不同组织部位分布差异的因素需要进一步探究。