保定市奶牛子宫内膜炎细菌分离鉴定和药敏试验

李 蕊，马玉忠，李睿文，汪恩强

（河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001）

子宫内膜炎目前仍是奶牛最常见的繁殖障碍性疾病之一，大多发于围产期，各种原因引起的病原菌感染是最常见的原因，导致产犊周期延长，奶产量和奶品质降低，奶牛不孕和不育等［1］，给奶牛业造成严重的经济损失，我国每年因奶牛子宫内膜炎损失上亿元［2］。引起奶牛子宫内膜炎的致病菌种类繁杂，尤其是近十几年，由于各地滥用抗生素药物，导致耐药菌株增多［3］，给临床治疗奶牛子宫内膜炎带来诸多困难。由于该病致病菌种类因地区而异，故对保定市部分地区患牛进行致病菌分离鉴定，查明当地奶牛子宫内膜炎主要致病菌种类，并通过药敏试验探索有效治疗药物，为防治该病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在保定市6 个区县的14 个奶牛场中，按照奶牛子宫内膜炎诊断依据，并据临床症状与发情情况以及直肠检查结果，选取76 头经确诊患临床型子宫内膜炎的奶牛，无菌采集子宫内容物，用于奶牛子宫内膜炎的细菌分离鉴定和药敏试验。

1.2 试验用品和试剂

苏州净化SW-CJ-2D 型超净工作台；上海精宏HZP-250 型全温振荡培养箱；上海精宏DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱；CKX41-A32RC 型奥林巴斯显微镜；美的低温电冰箱；鲜血琼脂培养基、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、生物酪蛋白琼脂培养平板、普通营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基等；药敏试纸片（青霉素、新霉素、链霉素、卡那霉素、强力霉素、庆大霉素、四环素、氨苄西林、环丙沙星、复方新诺明、诺氟沙星、头孢西丁、头孢噻肟、氟苯尼考），均购自杭州天和微生物试剂有限公司；微量生化鉴定管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、V-P 试验、M-R 试验、尿素、过氧化氢酶、吲哚试验、亚硝酸盐还原试验），杭州天和微生物试剂有限公司产品；高压灭菌器，无菌小试管，染色液等。

1.3 致病菌分离鉴定

1.3.1 样本的采集将临床型子宫内膜炎患牛行保定架保定，用0.3% 的K2MnO4溶液冲洗外阴，运用直肠把握法将灭菌输精管插入子宫内部，输精管外侧端连接装有30 mL 生理盐水的无菌注射器，反复抽吸，将吸取至注射器内的子宫冲洗液快速转移至无菌试管内，并做好标记，放入低温保温箱送检。

1.3.2致病菌分离培养将采集的子宫冲洗液样品分别接种于普通营养肉汤和鲜血琼脂培养基中，进行有氧和厌氧鉴定培养，37 ℃培养24 h，观察并记录培养物的生长特点以及菌落形态。同时，挑取生长特点不同的单菌落进行涂片，革兰氏染色镜检，观察细菌的染色特性和形态结构。根据培养物细菌的镜检结果，结合菌落的生长特点和形态，选择特征性的菌落分别接种于鲜血琼脂培养基、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、生物酪蛋白琼脂培养平板、普通营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基等，置37 ℃培养箱进行纯培养，供细菌鉴定用。

1.3.3 致病菌鉴定培养特性鉴定：细菌经上述培养基纯培养后，观察菌落生长情况、菌落形态特征，以及经普通肉汤培养基培养后，观察肉汤的透明度和浑浊度，管底有无沉淀及沉淀的特征等。

染色镜检鉴定：细菌涂片，革兰染色镜检，根据细菌染色特性和细菌大小、形态、结构等特征进行鉴定。

生化鉴定：经培养特性和染色镜检初步鉴定的菌株进一步生化鉴定，记录鉴定结果。

1.4 药敏试验

运用药敏纸片扩散法，即Kirby-Barer 法［4］分别对分离菌株进行药敏试验。挑选经分离、纯化及鉴定的各类菌株，各选取15 株使用生理盐水稀释至1.5×108CFU/mL，吸取100 μL 稀释液移至生物酪蛋白琼脂培养平板上，37 ℃恒温培养10 min，在平板表面平铺药敏纸片，各平皿中分别放置5 张，各菌种均设置3 个重复。将放有药敏纸片的平皿37 ℃恒温培养24 h，使用游标卡尺对抑菌圈直径进行测量并记录。结果参照CLSI 药敏试验国标进行判定［5］，分为耐药珠（R）、敏感株（S）及中敏株（I）。

1.5 数据统计分析

本试验数据使用SPSS22.0 软件进行统计学分析，采用t 检验，P ＞0.05 表示差异不显著，P ＜0.05表示差异显著，P ＜0.01 表示差异极显著。

2 试验结果

2.1 保定市奶牛子宫内膜炎致病菌感染情况

从76 份子宫分泌物样品中，有73 份分离出细菌，致病菌的检出率为96.1%。其中单一致病菌感染样本14 份，感染率为18.4%，多致病菌感染样本59 份，感染率为77.6%（见表1），可见多致病菌感染的奶牛子宫内膜炎极显著高于单一致病菌感染（P ＜0.01）。

表1 奶牛子宫内膜炎致病菌感染情况Table 1 Pathogenic bacteria infection of dairy cow endometritis

2.2 奶牛子宫内膜炎致病菌鉴定结果

对保定市子宫内膜炎患牛分离出的致病菌进行菌落形态特征、生长特性观察以及革兰氏染色镜检，初步鉴定出7 类致病菌，分别为链球菌、葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、屎肠球菌、绿脓杆菌和棒状杆菌（见表2）。

对初步分离鉴定的致病菌进行生化鉴定，结果见表3。

表2 奶牛子宫内膜炎致菌病初步鉴定结果Table 2 Preliminary identification results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis

表3 致病菌生化鉴定结果Table 3 Biochemical identification results of pathogenic bacteria

综合致病菌初步鉴定和生化试验结果，共鉴定出8 种48 株致病菌（见表4），不同致病菌的感染率差异极显著（P ＜0.01），其中金黄色葡萄糖球菌的检出率最高，占27.1%（13/48），其次是链球菌和大肠埃希菌，分别占20.8%（10/48）和18.8%（9/48），3 种致病菌的检出率显著高于其他致病菌（P ＜0.05 或P ＜0.01）。

表4 奶牛子宫内膜炎致病菌鉴定结果Table 4 Identification results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis

2.3 子宫内膜炎致病菌药敏试验结果

对分离鉴定的8 种子宫内膜炎致病菌分别用14 抗菌药物进行药敏试验，结果见表5。由表5可知，新霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、头孢西丁和头孢噻肟均对主要致病菌金黄色葡萄糖球菌、链球菌和大肠埃希菌高度敏感，而对青霉素、四环素、复方新诺明、庆大霉素、卡那霉素等表现不同程度的耐药。

表5 奶牛子宫内膜炎致病菌药敏试验结果Table 5 Drug sensitivity test results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis

3 讨论

3.1 奶牛子宫内膜炎致病菌分离鉴定

奶牛子宫内膜炎严重影响奶牛业发展，造成巨大经济损失。引起奶牛子宫内膜炎的病原很多，有细菌、病毒、真菌、支原体等，但报道最多的主要是细菌，因为奶牛分泌后子宫颈口处于开放状态，环境中的细菌很容易进入子宫内，再加上子宫内适宜的温度、湿度和酸碱度，为细菌生长繁殖提供了保障，因此应加强围产期奶牛的饲养管理，搞好环境卫生，切断奶牛子宫内膜炎的传染源，是有效预防奶牛子宫内膜炎的关键措施。

由于地区不同，环境各异，引起奶牛子宫内膜炎的细菌分布特点也不相同，这可能与各地区气候环境特点、饲养管理水平、奶牛自身子宫和阴道内环境以及免疫调节水平等因素有着密切联系。胡文举等2014 年研究发现，河南平顶山地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌为蜡样芽孢杆菌，大肠埃希菌，奥斯陆莫拉菌等［6］；赵清梅等2015 年研究发现，宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌为大肠埃希菌55.56%，金黄色葡萄球菌35.9%［7］；王军等2018年研究发现，郑州市奶牛子宫内膜炎主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产吲哚金黄杆菌、蜡样芽孢杆菌［8］；戴浩楠等2016 年研究发现，雁门关地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌为芽孢杆菌30.56%，大肠埃希菌14.81%，肠球菌12.96%，葡萄球菌9.26%，链球菌6.48%［9］。本试验从76 份保定市奶牛子宫内膜炎子宫分泌物样本中，有73 份检出致病菌。对致病菌进行分离鉴定，共鉴定出8种致病菌，主要致病菌为葡萄球菌（37.5%）、链球菌（20.8%）和大肠埃希菌（18.8%），且保定市奶牛子宫内膜炎大多为多致病菌混合感染，这与陈星、凌丁、陈强、李宏胜等人的报道结果不同［10-13］，可见各地区致病菌的感染类型各异，可能与地区差异、饲养管理水平及奶牛自身品种和体质不同相关。

3.2 奶牛子宫内膜炎致病菌药敏试验

药敏试验结果表明，保定市奶牛子宫内膜炎主要致病菌的高度敏感性药物为诺氟沙星、氟苯尼考、新霉素、头孢西丁和头孢噻肟，青霉素、四环素和复方新诺明为不敏感药物，该试验结果对保定市奶牛子宫内膜炎的防治可提供有力的科学依据。关于致病菌对某些药物产生耐药性的现象，可能由于奶牛临床上滥用抗生素药物所致，建议完善饲养管理体制，制定安全、合理用药规则；增强预防意识，重视对疫苗、微生态制剂和中兽药等药物的研发及投入使用。控制对于抗生素的使用，采用轮换、穿插用药的方式，减少耐药性药物的产生。定期进行实验室鉴定及探究，及时了解并使用效果最佳药物，提高治愈率。