泰妙菌素高产菌的紫外诱变选育

陈亚兰 陈德刚 张冰莹

摘 要：为了进一步提高泰妙菌素的发酵水平，通过单因素试验确定生产菌T19-127L最佳种瓶培养时间为4d，最佳发酵周期为9d，最佳紫外照射时间为160s;采用紫外诱变技术，筛选到1株突变菌株，遗传性状稳定;通过发酵摇瓶验证，其摇瓶效价为13352u·mL-1，比出发菌株（9605u·mL-1）提高39%，连续传代实验结果表明，其具有良好的遗传稳定性。

关键词：泰妙菌素;紫外诱变;选育;效价

中图分类号：S-3       文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930016

泰妙菌素（Tiamulin，TML）别称泰妙灵、支原净等[1]，是一种常见的半合成的双萜烯类兽用抗生素[2]。TML是担子菌侧耳属发酵得到截短侧耳素后，再经化学合成方法得到其氢化延胡索酸盐，TML是首个截短侧耳素（Pleuromulin）类的兽用药物[3]。

目前，为获得满足生产需求的目的菌株，常采用自然选育、诱变育种、全局转录工程等技术手段来改造菌株[4]。紫外线诱变（Ultraviolet Mutagenesis，UV mutagenesis）是常见的物理诱变方式，广泛用于微生物菌种的诱变处理，并且有着悠久的历史[5，6]。紫外线能量低，对核酸造成的伤害比较单一，具有操作简便、效率高、安全性好、诱变效率高等优点，在避光条件下诱变结束后已产生突变的性状不易恢复，因此应用较广泛[7，8]。UNDERT等[9]利用紫外线照射裂褶菌，获得了3株突变株;MUKHERJEE等[10]利用紫外线处理的草菇原生质体，获得了4株形态发生突变的菌株和1个营养缺陷型菌株;郑哲等人利用紫外诱变得到1株较出发菌株产纤维素酶活力提高了40.08%的突变菌株[11]。目前与担子菌相关的紫外诱变育种的报道较少，本研究为担子菌诱变育种提供了参考，也为工业生产提供了有效依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

泰妙菌素生产菌（Clitopilus prunulus），菌种号为T19-127L，由宁夏泰瑞制药集团股份有限公司提供。

1.1.2 培养基

斜面/平板培养基：葡萄糖40g·L-1、胰蛋白胨10g·L-1，琼脂20g·L-1，pH自然。

种瓶培养基：葡萄糖50g·L-1、酵母提取物20g·L-1、MgSO4·7H2O 0.55g·L-1、FeSO4 0.05g·L-1、Ca（NO3）2 0.5g·L-1，pH 6.2。

發酵培养基：葡萄糖60g·L-1、玉米浆25g·L-1、黄豆饼粉4g·L-1、MgSO4·7H2O 0.4g·L-1、CaCO3 0.9g·L-1、豆油0.6g·L-1，pH 6.7。

1.2 仪器与设备

FA2014N分析天平，北京东南仪诚实验室设备有限公司;LDZX-50KBS立式高压灭菌器，上海申安医疗器械厂;HR40-A2生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司;MJX-160-Z霉菌培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;FE20 PLUS pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;YT-CJ-2N双人双面净化工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司;HZQ-F280全温振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂;PSX智能型恒温恒湿培养箱，宁波莱福科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 T19-127L菌的活化和菌悬液的制备

无菌环境中，取约3cm2的菌丝斜面于研磨器中，加入适量的无菌水，充分研磨，使菌丝断裂;吸取1mL研磨液于斜面，涂布均匀后，置于27℃培养箱培养。

1.3.2 T19-127L菌生长曲线的测定

无菌环境中，取约3cm2的菌丝斜面于研磨器中，加入适量的无菌水，充分研磨，将其全部转移至种瓶培养基，27℃、220r·min-1培养。每隔24h取1次样，称取10g种瓶培养物于3000r·min-1离心10min，除去上清液，记录沉淀质量，计算菌浓。用菌浓反应菌体的生长情况，并绘制培养时间—菌浓曲线，菌浓的计算公式：

W=mM×100%（1）

式中，W为菌浓，%;m为沉淀的质量，g;M为种瓶培养物质量，g。

1.3.3 T19-127L发酵周期的测定

无菌环境中，按照10%的接种量将种瓶培养物转接至发酵瓶，27℃、220r·min-1培养。每隔24h取1次样，测定发酵液的pH和效价。

1.3.4 紫外诱变实验

无菌环境中，取约3cm2的菌丝斜面于研磨器中，加入适量的无菌水，充分研磨，制得菌悬液，备用。将菌悬液稀释1000倍，取0.1mL稀释液于培养皿，并涂布均匀，置于27℃培养箱中预培养48h后，用紫外灯照射0s、10s、20s、40s、80s、160s、320s、420s（培养皿至紫外灯的垂直距离保持30cm，15W紫外灯），照射结束后继续于27℃避光培养，防止光复活，平板计数，计算致死率，随机选取单菌落制成试管斜面保藏，进行效价验证。致死率的计算公式：

z=xX×100%（2）

式中，z为致死率，%;x为紫外线处理后的单菌落数，个;X为对照组的单菌落数，个。

1.3.5 最适生长pH实验

将突变株菌悬液稀释1000倍后，吸取0.1mL稀释液，分别接种到pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的固体培养基中，并设置3组平行试验。于27℃恒温培养，观察菌落的形成情况。

1.3.6 发酵特性验证

将出发菌株T19-127L与筛选出的突变菌株按照10%的接种量分别接种到发酵培养基中，并设置3组平行试验，于27℃，220r·min-1的振荡培养箱中进行发酵，培养8d后测定发酵液的pH值和效价。

1.3.7 遗传稳定性试验

将筛选出的突变菌株进行5次传代培养，并将每代突变菌株菌悬液按照5%的接种量接种于pH7.5的发酵培养基中，并设置3组平行试验，27℃、220r·min-1振荡培养8d后，测定每代突变菌株的产素能力，从而验证菌株的突变性能是否能够稳定遗传。

1.3.8 检测方法

pH值，采用pH酸度计对发酵液的pH值进行测定。

截短侧耳素高效液相色谱法检测，配制浓度分别为0.25mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.0625mg · mL-1、0.03125mg · mL-1、0.015625mg · mL-1、0.007813mg · mL-1的截短侧耳素标准品甲醇溶液，进行高效液色谱测定，每个浓度重复3次。HPLC液相条件为乙腈：0.02mol·L-1KH2PO4=45：55，UV205nm，流速1mL·min-1，柱温27℃[12]。

2 结果与讨论

2.1 生长曲线

微生物发酵产物的含量与接入发酵瓶的种子的活性有直接关系，通常选择处于对数生长期的种子进行转接发酵。通过图1可知，菌株T19-127L在第2～7天处于对数生长期，分别将培养3d、4d、5d的种子转接发酵瓶。培养8d后，测截断侧耳素的含量发现，培养4d的种子具有较高的产素能力，因此将种瓶培养时间确定为4d。

2.2 发酵周期

出发菌株T19-127L产素能力与培养时间的关系如图2所示。效价呈现先增后减的趋势，培养至第9天效价达到最大;pH则呈现出先增后平的趋势，同样培养至第9天发酵液pH出现最大值，发酵第9～11天一直处于7.78左右。因此，将发酵周期确定为9d。

2.3 正向突变菌株的筛选

将预培养物用紫外线处理后，单菌落数随处理时间的变化情况如图3所示。随紫外灯照射时间的增加，培养皿中单菌落数依次减少，而致死率则依次增加。其中，紫外灯照射80～160s时，致死率在50%～80%;紫外灯照射420s时，致死率达97%，说明紫外照射时间对致死率有着重要的影响。通常正向突变一般都出现在70%～80%致死率中[13]，因此实验选择的最佳辐照时间为160s，此时菌株致死率为80%，较符合正向突变的理想致死率。随机挑选14株单菌落制备试管斜面，4℃保藏，备用。

2.4 菌种发酵能力测试结果

分别将14株突变株接种于种瓶培养基中，27℃培养，220r·min-1培养4d后，按照10%的接种量转接发酵培养基，相同条件下培养9d后用液相色谱法测定发酵液的效价。其中，3株菌种的效价提高了5%～10%;有7株菌种的效价提高了10%～20%;有2株菌种的效价提高了20%～30%，正突变率达到85.7%。

2.5 遗传稳定性试验结果

根据生产需求，选择9号菌株连续培养5代，每代菌株均进行发酵验证，发酵液的效价如图4所示。图4可以直观反映出突变株的第3代和第4代具有较高的产素能力，但是这5代的产素能力的差异性不显著（P>0.05），说明突变株在传代过程中具有稳定的遗传性。

3 结论

工业生产中，诱变育种是获得高产菌株常用的方法，都雯玥[14]对Clitopiluspinsitus的原生质体进行重离子辐照诱变，最终选育出C.pin15I5E和C.pin15II6B2株正变异株，其产量较出发菌株分别提高16.17%和15.47%;何海燕[15]等人通过微波诱变获得果胶酶高产菌株;陈晓丽利用制霉菌素筛选得到截短侧耳素高产菌，其效价提高了38.5%。本研究为提高泰妙菌素的发酵水平，采用经典的紫外诱变技术对泰妙菌素生产菌T19-127L进行选育。经紫外诱变，正突变率达到了85.7%，通过大量筛选得到2株菌泰妙菌素突变株，比出发菌株效价提高20%～40%，其中T19-20（13352u·mL-1）的效价最高，比出发菌株T19-127L（9605u·mL-1）提高了39%，且具有良好的遗传稳定性。

参考文献

[1] 王俊萍，冀建军，田启超，等.乌鸡泰妙菌素中毒诊断与治疗[J].畜牧与兽医，2016，48（03）：164.

[2]刘东良，贾海燕，魏建超，等.截短侧耳类药物耐药机制研究进展[J].畜牧与兽医，2017，49（02）：107-111.

[3]黄贺贤，曾振灵，黄显会.截短侧耳素类抗生素——泰妙菌素的研究进展[J].中国兽药杂志，2010，44（06）：42-45.

[4]尤亮，丁东栋，崔志峰.乙醇耐受性釀酒酵母菌株选育的研究进展[J].工业微生物，2016，46（03）：51-54.

[5]许翠，高梦祥.微生物菌种诱变筛选方法及其应用[J].长江大学学报（自然科学版），2013（12）：56-60.

[6]曹礼，王晓琴，李彩霞，等.酿酒酵母菌的紫外诱变及其突变株的性能测定[J].中国酿造，2009，28（10）：66-68.

[7]ZHUM，LIP，GONGX，et al.A comparison of the production of ethanol between simultaneous saccharification and fermentation and separate hydrolysis and fermentation using unpretreated cassava pulp and enzyme cocktail[J]. J Agr Chem Soc Jpn， 2012， 76（4）：671-678.

[8]杨小冲，陈忠军，赵洁，等. 紫外诱变选育耐酸酵母菌株及其特性研究[J]. 中国酿造， 2017， 36（10）：109-113.

[9] Hundert P，Koltin Y，Stamberg J，et al.Repair of UV-induced damage in wild-type and mutant strains of Schizophyllum commune[J].MutationResearch/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，1978，50（02）：157-162.

[10]Mukherjee M，Sengupta S.Mutagenesis of protoplasts and regeneration of mycelium in the mushroom Volvariella volvacea[J].Applied and Environmental Microbiology （USA），1986，52（6）：1412-1414.

[11] 郑哲，贾翠英，张玉辉.一株产纤维素酶细菌紫外线诱变研究[J].生物学杂志，2011（03）：66-69.

[12]张婷，金鑫，李倩，等.高效液相色谱法测定截短侧耳素的含量[J].化学与生物工程，2014，31（10）：69-70.

[13]张丽萍，程辉彩，田连生，等.植酸酶高产菌株的紫外线——空气等离子体复合诱变选育[J].中国饲料，2006（09）：13-15.

[14]都雯玥.重离子辐照并筛选截短侧耳素高产菌株的研究[D].兰州：兰州理工大学，2016.

[15]何海燕，覃拥灵，陆世则，等.产果胶酶棘孢曲霉的筛选鉴定及微波诱变育种[J].中国饲料，2015（02）：20-22.

（责任编辑  周康）