菌种对发酵红茶水溶液香气品质的影响

林 琦，李利君,2,3，伍 菱,2,3，黄高凌,2,3,，翁淑燚，倪 辉,2,3，李清彪,2,3，张树文，黄幼林

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021；4.大闽食品（漳州）有限公司，福建 厦门 361021；5.集美大学理学院，福建 厦门 361021）

茶叶是我国重要的农产品，按照加工工艺的不同，茶叶可分为白茶、绿茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶共6大类。红茶是一类传统的茶叶，属于全发酵茶，近年来产量快速增长，根据国际茶叶委员会统计数据显示，2018年全球红茶产量600万 t，比2017年全球红茶产量增加了15.8万 t。相关研究表明，红茶富含多种生物活性物质，具有减肥消炎[1]、保护神经[2]、预防心血管疾病[3]的功能。相关研究表明，茶叶水溶液经过微生物发酵后，不仅具有显著的抗氧化性和抗菌性等功能[4]，而且具有特殊的风味[5]。例如，采用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多菌种混合发酵的红茶菌[6]，具有预防糖尿病、改善肠道微生物，治疗非酒精性脂肪肝等功能[7-8]，并产生了丰富的醇类、醛类、酮类、酸类、酯类等物质[9]，使发酵后的茶叶具有更好的风味。因此，利用微生物发酵增加茶叶水溶液及茶饮料的生物活性及风味日渐成为茶叶深加工的重要技术手段。目前，相关研究对微生物发酵引起的茶叶活性进行了大量研究，在此基础上，深入研究微生物发酵对香气的影响，将进一步促进高质量茶叶产品的开发。

目前常见的香气萃取方式有顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）、超声辅助萃取[10]、搅拌棒吸附萃取[11]、同时蒸馏萃取[12]、静态顶空[13]、溶剂辅助蒸发[14]、液液萃取[15]、超临界萃取[16]、动态顶空[16]等，其中，SPME具有人工操作快速、简单，集萃取、浓缩和进样于一体的优点。香气成分分析检测方法包括气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[12]、气相色谱-嗅闻[11]、气相色谱-飞行时间质谱[17]、电子鼻[18]、气相色谱-燃烧同位素比值质谱法[19]、气相色谱-氢火焰离子化法[20]等，其中GC-MS既有质谱的高灵敏度和气相色谱的高分辨率，又能准确进行定性和定量分析[21]。相关学者通过HS-SPME结合GC-MS分析研究，发现乳酸菌发酵后，铁观音浸提液的醇类、酮类和酯类香气成分在发酵后较发酵前有明显增加[22]；Pripdeevech等[5]采用HS-SPME结合GC-MS分析，研究发现乌龙茶经过枯草芽孢杆菌发酵后主要挥发性成分显著增加。但是，目前对发酵茶叶水溶液及茶饮料风味随菌种变化的规律缺乏系统对比研究。

本研究以红茶水溶液为对象，分别用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌进行发酵，并采用感官评价和HS-SPME结合GC-MS对比分析各菌种对茶叶香气的影响，旨在丰富发酵菌种对发酵茶叶水溶液及茶饮料风味影响的风味基础，同时为通过菌种优化而调控发酵红茶饮料的风味质量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶叶 莆田市天林茶叶有限公司；正构烷烃（C8～C20）、环己酮（1 g/mL）、β-月桂烯、顺式-3-乙烯醇、1-乙基吡咯、芳樟醇氧化物和顺-3-己烯基丁酸酯美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇（优级纯） 国药集团化学试剂有限公司；蔗糖（食品级） 厦门古龙食品有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（食品级）安琪酵母股份有限公司；果醋醋杆菌（Acetobacter acetigenoideum）（食品级） 烟台帝伯仕自酿机有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（食品级） 山东中科嘉亿生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

QP-2010 Plus GC-MS仪 日本岛津公司；Rtx-5MS毛细管色谱柱（60 mm×0.32 mm，0.25 μm）美国Restek公司；HH-157330-U手动SPME进样器、75 μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵红茶水溶液的制备

按茶水比1∶100（g/mL），90 ℃冲泡3 min。制备1 500 mL红茶水溶液，冲泡过程中用保鲜膜封口。冲泡完成后，冷却到室温，过滤茶渣得到红茶水溶液。接着加入7%的蔗糖，将红茶水溶液分装成每瓶为150 mL。将调配好红茶水溶液在沸水浴中，灭菌15 min，并将其迅速冷却至30 ℃。灭菌中用12 层纱布包住。取其中的3 瓶红茶水溶液，分别向其加入0.1%酵母菌、0.1%醋酸菌、0.1%乳酸菌，于30 ℃的恒温培养箱中，培养3 d。每种菌种做3 个平行实验。发酵结束后，立即放入冰箱中冷藏。以原红茶水溶液作为空白对照样品。

1.3.2 发酵红茶水溶液香气轮廓的分析

发酵完成后，根据ISO 8589标准和相关文献方法建立红茶发酵液气味特征感官评价标准表（表1），配制一系列不同浓度的香气标准品。选择10 名感官评价人员（具有3 个月以上感官评价的经验）包括5 名女性和5 名男性，对红茶发酵液及原红茶水溶液进行感官评价，其中1 分表示香气强度较低，4 分表示香气强度中等，9 分表示香气强度较高。评价过程中，室温保持（25±2）℃，相对湿度在50%～75%之间，室内无其他气体干扰并保持通风。

表1 标准溶液的气体特征与强度Table 1 Aroma characteristics and strength of volatile standard solutions μg/L

1.3.3 发酵红茶水溶液挥发性成分的定性分析

准确量取10 mL样液置于50 mL萃取瓶中，再加入20 mL的超纯水和10 μL的内标物环己酮，混匀之后将萃取瓶放入40 ℃水浴锅中平衡1 h，最后将老化后的固相微萃取头插入萃取瓶中吸附20 min。

色谱条件：色谱柱为Rtx-5MS（60 m×0.32 mm，0.25 μm），用高纯氦气（纯度99.999%）作为载气，柱流量为3 mL/min，不分流进样。升温程序：程序升温，进样口温度为230 ℃；初温度为50 ℃并保持5 min，以3 ℃/min升温至200 ℃，在200 ℃保持1 min。

质谱条件：离子源温度为200 ℃，电离方式为电子电离源，电离能量为70 eV，接口温度为250 ℃，选择SCAN模式为扫描方式进行定性分析，离子碎片的扫描范围为m/z35～500。溶剂延迟时间为2.5 min。

定性分析：采用质谱数据库（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）进行相似度检索，计算样品中挥发性成分的保留指数与文献报道的保留指数进行比对以及特征离子碎片等进行定性分析，其中保留指数运算参照Kratz和Vandendool的方法。

式中：RI为保留指数；TR为保留时间；x为待测组分；n和n＋1分别为待测组分出峰前后相邻的两个正构烷烃的碳原子数。

1.3.4 发酵红茶水溶液挥发性成分的定量分析

采用内标法进行定量分析，将已知浓度的内标物环己酮和一定含量的待分析样品混匀后，再对含有内标物的待测样品进行色谱分析，根据待测样品和内标物的峰面积，按照式（2）计算待测组分在样品中的含量。

1.4 数据统计与分析

使用Excel 2013对不同菌种发酵红茶水溶液的挥发性成分进行统计分析，制作感官评价雷达图、柱状图。使用加权平均法对香气轮廓进行统计学分析。使用SPSS 22.0对不同菌种发酵红茶水溶液的挥发性成分进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同菌种发酵处理对红茶水溶液香气轮廓的影响结果

图1 不同菌种发酵红茶水溶液的感官评价雷达图Fig.1 Sensory evaluation radar map of black tea infusion fermented by different strains

如图1所示，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌对红茶水溶液的花香、甜香、青草香、果香和烘烤香都有显著影响，其中酵母菌、醋酸菌、乳酸菌发酵红茶水溶液后，红茶水溶液的果香显著增加，而花香、甜香和青草香降低；此外，用酵母菌、乳酸菌发酵可显著降低烘烤香，而醋酸菌却显著增加了红茶水溶液的烘烤香。有研究表明乳酸菌发酵果蔬汁增加了果香味[23]；Mukisa等[24]采用酵母菌和乳酸菌生产高粱发酵饮料，果香显著增加；Tu Chunhai等[25]利用红茶菌发酵大豆乳清，产生了新的芳香活性物质，使大豆乳清具有果香味。该结论与本实验相似。

进一步分析表明（图2），乳酸菌发酵红茶水溶液的可接受程度最高，通过加权平均法，以及与3 种菌种发酵红茶水溶液的香气轮廓结合进行分析，其分值为6.3。加权分析法是指在计算若干个数量的平均数时，为了考虑每个数量在总量中具有的重要性不同，可分别给予不同的权数，按不同的权数计算所得的各数量的平均数[26]。有研究采用加权平均法表述菌落总数测定的数学模型[26]。因此，本实验在一般的加权平均法的基础上稍作改进，对花香、甜香、青草香、果香和烘烤香给予不同的权数，通过式（3）[27]进行回归分析，经计算得出，x1=1.22，x2=0.09，x3=－0.23，x4=0.39，x5=－0.47。可知花香、甜香和果香对可接受程度影响为正相关，青草香和烘烤香对可接受程度影响为负相关，其中增加果香、甜香和花香，降低青草香和烘烤香是提高红茶水溶液可接受程度的主要因素。

式中：x1为花香的权数；x2为甜香的权数；x3为青草香的权数；x4为果香的权数；x5为烘烤香的权数； 为可接受程度值。

图2 不同菌种发酵红茶水溶液的可接受程度值Fig.2 Acceptability scores of black tea infusion fermented by different strains

2.2 不同菌种对红茶水溶液挥发性成分的定性分析

如图3和表2所示，共鉴定出73 种挥发性成分，包括酯类23 种，醇类18 种，醛类8 种，烯烃类6 种，酮类7 种，酸类5 种和其他6 种。原红茶水溶液中共鉴定出30 种挥发性成分，包括醇类8 种，烯烃类6 种，醛类8 种，酯类4 种，酮类1 种和其他3 种，由此可知其主要挥发性成分为醇类、烯烃类和醛类。卢艳等[28]将GC-MS采集的质谱图与NIST 08标准质谱库进行对照，并结合文献对比，进行定性，表明正山小种中的香气成分有醇类、醛类、酮类和酯类等，与本实验结果有一定的差异，其可能是原料及测定方法不同等原因。酵母菌发酵红茶水溶液中共鉴定出46 种挥发性成分，其中醇类13 种，酯类18 种，酸类5 种，烯类3 种，醛类3 种，酮类3 种和其他1 种，由此可知其主要挥发性成分为醇类和酯类。邹聪丽[29]采用质谱计算机数据系统检索进行定性分析，研究表明酵母菌发酵红茶水溶液后主要香气成分由醇类和醛类变为醇类物质和酯类物质，呈现出显著的酒香味和果香味，与本实验结果一致。醋酸菌发酵红茶水溶液中共鉴定出33 种挥发性成分，其中醇类16 种，醛类5 种，酯类3 种，烯类2 种，酸类1 种，酮类3 种和其他3 种，由此可知其主要挥发性成分为醇类和醛类。张义杰等[30]通过Nist 08数据库进行定性分析，研究表明醋酸菌发酵西瓜汁的主要挥发性成分为醇类、酯类、醛类和酸类，果香味显著增加，也具有青草香、花香和甜香，和本实验结果相符。乳酸菌发酵红茶水溶液中共鉴定出32 种挥发性成分，醇类11 种，醛类7 种，酯类6 种，酮类4 种，烯类2 种和其他2 种，由此可知其主要挥发性成分为醇类、酯类、醛类和酮类。刘佳奇等[31]通过Agilent Mass Hunter进行数据采集和分析，并通过Central Authentication Service（CAS号）及配比度进行定性，研究表明植物乳杆菌发酵红茶水溶液得到的香气成分主要有醇类和酮类，与本实验结果相似。

图3 不同菌种发酵红茶水溶液中挥发性成分的总离子流图Fig.3 Total ion flow chromatograms of volatile components in black tea infusion fermented by different strains

表2 不同菌种发酵红茶水溶液中挥发性化合物的定性结果Table 2 Qualitative results of volatile compounds in black tea infusion fermented by different strains

续表2

2.3 不同菌种对红茶水溶液挥发性成分的定量分析

如表3所示，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌发酵红茶水溶液产生的挥发性成分的种类和含量有所差异，与原红茶水溶液相比，增加了一些挥发性成分。原红茶水溶液的挥发性成分为醇类（60.13 μg/L）、酯类（35.81 μg/L）、酮类（6.22 μg/L）、醛类（115.13 μg/L）、烯烃类（239.56 μg/L）和其他（40.40 μg/L），其含量较高为顺式-3-己烯醇（21.07 μg/L）、苯甲醛（39.61 μg/L）、壬醛（24.51 μg/L）、柠檬烯（178.42 μg/L）、萜品烯（28.36 μg/L），其中苯甲醇、香叶醇、苯乙醇、水杨酸甲酯、糠醛是其主要的香气物质[28]，糠醛具有烘烤香和甜香[34]，苯甲醛具有焦糖香[34]，苯甲醇具有花香和甜香[34]，柠檬稀具有青草香[35]和果香[36]，苯乙醇具有花香和甜香[34]，顺式-3-己烯醇具有青草香[34]，这些物质的香气特征和实验结果感官检验的红茶香气特征一致。

酵母菌发酵红茶水溶液产生的挥发性成分最多，增加了醇类物质（1 605.93 μg/L）、酯类物质（7 715.82 μg/L）和酸类物质（596.15 μg/L），降低了醛类物质（69.48 μg/L），且酯类物质和醇类物质含量最高，对气味特征贡献较大。其中红茶的主体香气成分苯乙醇、水杨酸甲酯的含量显著增加，增加了红茶的主体香味，己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和辛酸是果酒中的主要香气成分[37]。如图4所示，酵母菌发酵红茶水溶液中酯类物质占挥发性成分的73%，显著增加；与原茶水溶液以及醋酸菌和乳酸菌发酵红茶水溶液相比，酸类物质含量较高，而其他物质含量显著降低，因此，果香显著增加，而花香、青草香、甜香和烘烤香显著降低。这也是酵母菌发酵红茶水溶液可接受程度低于乳酸菌发酵红茶水溶液的主要原因。

醋酸菌发酵红茶水溶液增加了醇类物质（178.33 μg/L）和酮类物质（14.15 μg/L），降低了烯烃类物质（19.37 μg/L），其酯类物质和醛类物质含量最高，对气味特征贡献较大。如图4所示，醇类物质和醛类物质相对含量高达67%，与酵母菌和乳酸菌发酵红茶水溶液相比，酯类物质含量降低，与原红茶水溶液相比，酯类物质含量增加；烯烃类物质与原红茶水溶液相比显著降低；酮类物质与乳酸菌发酵红茶水溶液相比显著降低。苯乙醇具有烘烤香，壬醛具有油脂香，顺式-3-己烯醇具有木香和蘑菇香[38]，香叶醇具有花香，且醇类物质具有果香[39]，柠檬烯具有青草香，其含量显著降低。因此，这些成分变化与醋酸菌增加红茶水溶液的烘烤香和果香，降低了花香、青草香和甜香的结果一致，也使其可接受程度最低。

乳酸菌发酵后，红茶水溶液增加了醇类物质（90.70 μg/L）、酯类物质（53.91 μg/L）和酮类物质（19.82 μg/L），降低了烯烃类物质（10.89 μg/L）。刘佳奇等[31]研究表明植物乳杆菌发酵红茶水溶液得到的香气成分主要有醇类物质和酮类物质，与本实验结果一致。其中产生的新物质中，肉桂酸乙酯具有淡的甜蜂蜜香味和肉桂香味，十一酮具有桃子香[31]，酯类和高级醇具有果香[39]，总相对含量为53%；此外，柠檬烯含量和苯甲醛含量降低，苯甲醛具有花香和甜香，柠檬烯具有青草香。如图4所示，酯类物质、醇类物质、酮类物质和醛类物质总相对含量为86%，与原红茶水溶液以及酵母菌和醋酸菌发酵红茶水溶液相比，醇类物质、酮类物质和醛类物质都显著增加；而与原红茶水溶液和醋酸菌发酵红茶水溶液相比，酯类物质显著增加；烯烃类物质与原红茶水溶液相比显著降低。因而，乳酸菌发酵红茶水溶液果香增加，且降低花香、青草香、甜香和烘烤香的结果与这些成分变化的规律一致。根据感官评价得知，增加果香、甜香和花香，降低青草香和烘烤香是提高红茶水溶液可接受程度的主要因素。乳酸菌发酵红茶水溶液后，与酵母菌和醋酸菌发酵红茶水溶液相比，花香和甜香的降低程度小，其与原红茶水溶液较为接近。且果香增加，烘烤香减低，因此其可接受程度最高。

表3 不同菌种发酵红茶水溶液中挥发性化合物的定量结果Table 3 Quantitative results of volatile components in black tea infusion fermented by different strains

续表3

图4 不同菌种发酵红茶水溶液的挥发性成分含量差异图Fig.4 Comparison of concentrations of various classes of volatile components in black tea infusion fermented by different strains

3 结 论

香气轮廓分析表明，酵母菌发酵可显著增加红茶水溶液果香，并降低花香、青草香、甜香和烘烤香；醋酸菌发酵可增加红茶水溶液烘烤香和果香，并降低花香、青草香和甜香；乳酸菌发酵可增加红茶水溶液果香，降低花香、甜香、青草香和烘烤香。香气接受程度综合分析表明，乳酸菌发酵后红茶水溶液的香气可接受程度最高，而醋酸菌和乳酸菌发酵会降低红茶水溶液的香气可接受程度。加权平均法进行分析表明，红茶水溶液的香气可接受程度的增加与果香、甜香和花香增加及青草香和烘烤香降低密切相关。GC-MS分析表明酵母菌发酵后红茶水溶液香气接受程度的提高与醇类物质、酯类物质和酸类物质增加及醛类物质降低有关；醋酸菌发酵后红茶水溶液香气的变化与醇类物质和酮类物质增加及烯烃类物质降低有关；乳酸菌发酵后红茶水溶液香气改变与醇类物质、酯类物质和酮类物质含量增加及烯烃类物质减少有关。该研究为提高红茶的产品风味提供了研究参考。