不同产地广藿香的挥发油主成分分析及其遗传多态性的RAPD分析

高 静，赵智龙，唐莎莎，宫海燕*

(1.新疆医科大学第五附属医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆塔城市人民医院药剂科，新疆 塔城 834700；3.达州中医药职业学院，四川 达州 635000)

广藿香(Pogostemoncablin(Blanco) Benth.)是唇形科刺蕊草属植物，作为重要的药材和香料，具有芳香化湿、和胃止呕、祛暑解表的功效，成方制剂有藿香正气水、霍胆丸等[1]。藿香正气水作为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中医治疗中推荐的中成药，其主药藿香[2-3]多指广藿香，产于广东、海南、台湾等。现代药效学研究表明，挥发油是广藿香的主要活性成分，具有抑菌[4-5]、抗真菌[6]、抗氧化[7]、免疫调节[8]等作用，广藿香醇是广藿香挥发油的质量控制指标[9]。不同产地的广藿香挥发油的成分存在一定差异，如何进行质量控制和客观评价值得关注。

为有效控制广藿香挥发油的品质和明确地域特征，作者采用GC-MS方法对不同产地广藿香挥发油化学成分进行定性和定量分析，运用SIMCA+P统计软件进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术对不同产地广藿香的多态性和品种亲缘关系进行分析，探究不同产地广藿香挥发油含量和种质资源的分子学差异。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

广藿香，2017年7月分别采自云南曲靖县、广东化州市，经新疆医科大学中药鉴定教研室徐海燕副教授鉴定均为唇形科刺蕊草属植物广藿香(Pogostemoncablin(Blanco) Benth.)的干燥地上部分。

C7～C40正构烷烃混合标准品(CDGG-110219-06)，美国o2si公司；无水硫酸钠(分析纯)，天津永晟精细化工有限公司；正己烷(优级纯)，天津大茂化学试剂厂。

Agilent 7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪；索氏提取器；FA2004N型电子天平，常州幸运电子设备有限公司；KDM型可调控温电热套，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司。

1.2 广藿香挥发油的提取

将干燥的广藿香全草粉碎，过60目筛；称取广藿香粉末约50 g，置于1 000 mL烧瓶中，加500 mL水和数粒玻璃珠，振摇混合；采用水蒸气蒸馏法提取，直至观察挥发油的含量不再增加为止；停止加热，静置冷却，收集挥发油，无水硫酸钠干燥，称重，计算挥发油提取率，密封保存于4 ℃冰箱中，备用。

1.3 广藿香挥发油的化学成分分析

采用GC-MS联用技术，通过保留时间和对应的内部标准物(C8～C17)的比对，对挥发油的化学成分和色谱峰进行鉴定。在国际统一的实验条件下，采用NIST 14.L标准质谱谱库，对每个色谱峰对应的质谱进行检索得到其化学结构。

色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为高纯氦气，起始柱温50 ℃，以5 ℃·min-1的速率升温至300 ℃并保持20 min，进样量1 μL，分流比50∶1。

质谱条件：使用EI电离源，电离能量70 eV，离子源发生器温度230 ℃，进样口温度300 ℃，辅助加热器温度280 ℃，扫描范围40～800 amu，溶剂延迟3 min。

1.3.1 定性分析

通过比较各物质的质谱与NIST 14.L标准质谱谱库中相应物质的质谱的相似度匹配程度，结合正构烷烃标准物质的色谱程序升温保留指数(programmed temperature retention index,PTRI)，计算广藿香挥发油中各成分的保留指数(retention index,RI)，对挥发油化学成分进行定性分析。

1.3.2 定量分析

采用峰面积归一化法，计算广藿香挥发油中各化学成分的相对含量(%)，对挥发油化学成分进行定量分析。

1.4 广藿香的RAPD分析

1.4.1 引物的筛选

基于相关文献[10-13]，随机选择25个稳定性好、条带清晰的引物进行RAPD分析，分别是：S224、OPB11、OD603、S43、S208、S351、OPD08、OPD10、OPD07、S358、S359、S443、OPG19、S227、OPD13、OPB04、OPD70、OPD19、S42、OPA04、S202、OPD02、OPD18、OPD10、OPA07。

1.4.2 DNA的提取

取广藿香干重组织约60 mg，加入液氮充分研磨成粉末，迅速置于装有700 μL 65 ℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入疏基乙醇，使其终浓度为0.1%)，迅速颠倒混匀后于65 ℃水浴20 min，期间颠倒离心管数次以充分混合。加入700 μL氯仿，充分混匀，于12 000 r·min-1(约13 400×g，下同)离心5 min。小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀，转入吸附柱CB3中，于12 000 r·min-1离心30 s，弃掉废液。向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，于12 000 r·min-1离心30 s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，于12 000 r·min-1离心30 s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复上一步操作，将吸附柱CB3放回收集管中，于12 000 r·min-1离心2 min，弃掉废液。将吸附柱CB3于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，于12 000 r·min-1离心2 min，将溶液收集到离心管中，即得广藿香DNA。

1.4.3 DNA纯度检测

通过微量核酸测定仪测定不同产地广藿香的DNA纯度，结果见表1。

1.4.4 PCR反应

1.4.4.1 PCR体系的配制

反应体系：2×Taq PCR Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，引物1 μL，广藿香DNA 2 μL。

反应条件：88 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，38 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃保温10 min。

表1 不同产地广藿香的DNA纯度

1.4.4.2 琼脂糖凝胶的配制

称取0.6 g琼脂糖，溶于40 mL 1×1TBE电泳缓冲液中，微波加热2 min，边加热边混匀直至透明，室温静置10 min，加入2 μL核酸染料，倒胶，待其在室温下凝固，即得。

1.4.4.3 电泳点样

取扩增后的产物6 μL点于凝胶电泳孔中，在78 V、65 mA条件下电泳60 min，电泳结束后，在凝胶成像仪下观察，拍照。

1.4.4.4 数据处理

利用RAPD技术对数据进行处理。凝胶电泳图谱中的条带代表一个分子标记，代表一个引物结合位点；迁移率相同的条带作为同源条带，有带(显性)记为1，无带(隐性)记为0，强带和弱带都记为1；多态位点仅对在重复实验中能稳定出现的差异带进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 广藿香挥发油的化学成分分析

采用GC-MS方法，得到不同产地(云南、广东)广藿香的挥发油总离子流图，如图1所示。

图1 不同产地(云南、广东)广藿香的挥发油总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oil of Pogostemon cablin from different habitats(Yunnan,Guangdong)

由图1可以看出，云南广藿香和广东广藿香的挥发油成分均得到很好的分离，分离时间适中，峰形良好。

利用NIST 14.L标准质谱谱库结合保留指数法、峰面积归一化法对分离的挥发油化学成分进行鉴别归属并测定其相对含量，结果见表2。

表2

不同产地广藿香挥发油的化学成分及其相对含量

Tab.2 Chemical constituents of volatile oil of Pogostemon cablin from different habitats and their relative contents

由表2可知，从云南广藿香挥发油中分析鉴定出了48种化学成分，占总挥发油的99.93%；从广东广藿香挥发油中分析鉴定出了33种化学成分，占总挥发油的99.96%。云南广藿香挥发油中相对含量在5%以上的化学成分依次是：百秋李醇(28.53%)、苍术素(11.34%)、反式石竹烯(9.81%)、(+)-喇叭烯(8.81%)、α-杜松醇(7.78%)、甲基丁香酚(6.00%)、白菖烯(5.77%)，其主要成分是百秋李醇、苍术素、反式石竹烯；根据化合物分类，云南广藿香挥发油化学成分中单萜0.08%、倍半萜88.17%、含氧倍半萜2.94%、芳香族7.53%、其它1.21%，主要是倍半萜和芳香族类化合物。广东广藿香挥发油中相对含量在5%以上的化学成分依次是：百秋李醇(42.28%)、苍术素(10.59%)、反式石竹烯(8.08%)、(+)-喇叭烯(6.92%)、石竹素(6.07%)，其主要成分是百秋李醇、苍术素、反式石竹烯；根据化合物分类，广东广藿香挥发油化学成分中单萜0.11%、倍半萜85.27%、含氧倍半萜10.20%、芳香族4.35%、其它0.03%，主要是倍半萜和含氧倍半萜类化合物。云南和广东的广藿香挥发油有30个共同成分，其主要成分均为百秋李醇、苍术素、反式石竹烯。

百秋李醇具有钙离子拮抗、促进肠胃吸收和抗菌等药理作用。《中华人民共和国药典》(2015年版)中广藿香挥发油以百秋李醇作为质量控制指标，含量不得低于26%[9]，据此可判定，云南和广东的广藿香挥发油均达到质量要求，但两者的百秋李醇含量差异较明显，云南广藿香挥发油中百秋李醇含量为28.53%，广东的为42.28%，相差13.75%。以百秋李醇含量为评估指标，广东广藿香挥发油要优于云南广藿香挥发油。

本研究结果与其它研究结果存在差异：熊耀坤等[14]报道，广藿香挥发油中百秋李醇(广藿香醇)含量为19.43%，广藿香酮含量为37.79%；蒲秀峰等[15]报道，广藿香挥发油中百秋李醇最高含量为60.36%。

2.2 广藿香挥发油的主成分分析

运用SIMCA+P统计软件对云南和广东的广藿香挥发油的化学成分相关数据进行主成分分析，得到不同产地广藿香挥发油主成分分析载荷图及得分图，如图2所示。

图2 不同产地广藿香挥发油主成分分析载荷图(a)及得分图(b)Fig.2 Load diagram(a) and score chart(b) of principal component analysis of volatile oil of Pogostemon cablin from different habitats

载荷图显示了不同产地广藿香挥发油的化学成分在X轴方向和Y轴方向上的差别。由图2a可以看出，云南广藿香挥发油化学成分分布于2、3象限内，广东广藿香挥发油化学成分分布于1、4象限内，且未交叉重叠。说明云南和广东的广藿香挥发油的化学成分确实有明显的差异。

得分图显示了不同产地广藿香挥发油的化学成分在各象限的分布情况。由图2b可以看出，两个产地广藿香挥发油化学成分具有差异性：18种成分在广东广藿香挥发油中含量较高，即在得分图中1、4象限的是广东广藿香挥发油的差异性成分，而2、3象限属于云南广藿香挥发油的差异性成分。同时，主成分分析得到第一主成分占65.5%，第二主成分占17.4%，累计贡献值为82.9%，可说明大部分的成分数据。

2.3 广藿香的RAPD分析

基于前期研究，对25个随机引物进行筛选。分别以25个随机引物对不同产地广藿香基因组进行RAPD扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析。结果发现，25个随机引物均能扩增出条带，一共得到286条条带：云南广藿香扩增得到134条条带，广东广藿香扩增得到152条条带。扩增条带数最少的引物是S208、OPD07、OPD13、OPD19、OPD70，分别为3条；扩增条带数最多的引物是OPD19，为10条。每个引物能扩增的多态性DNA片段为3～10条，平均可扩增5.72条。

从25个随机引物中筛选出能够反映不同产地(云南、广东)广藿香多态性差异的特异性引物共6个，分别是：OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07，其RAPD扩增产物的电泳图谱如图3所示。

M:marker 1.云南广藿香 2.广东广藿香

2.4 讨论

采用GC-MS联用技术，测定不同产地广藿香挥发油的化学成分，发现云南和广东的广藿香挥发油中的百秋李醇含量差异较明显，云南广藿香挥发油中百秋李醇含量为28.53%，广东的为42.28%，相差13.75%。

云南和广东广藿香的品种亲缘关系较近，获得了6个特异性RAPD引物：OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07，为广藿香提供了分子学鉴定的依据。RAPD技术是评估不同产地广藿香遗传多样性的一个可靠有效的方法。根据RAPD分子标记多态性，可以估测不同产地广藿香品种之间的遗传关系。RAPD扩增快速、简易、灵敏，而且具有多态性，技术成熟，经济可行，可以快速进行分子学鉴定，为现有广藿香的优良种质资源研究奠定基础，有利于广藿香资源的鉴别和合理开发应用。

关于化学成分、分子学遗传的差异所引起的药效不同有待于进一步研究，也可考虑根据不同产地广藿香挥发油的主要成分及其对应的药理作用，进行广藿香的开发应用，促进中药资源的可持续发展，提高治疗效果。

3 结论

采用GC-MS联用技术，比较了不同产地广藿香挥发油的化学成分。结果表明，云南和广东的广藿香挥发油化学成分相近，有30个共同成分；其主要成分基本一致，均为百秋李醇、苍术素、反式石竹烯；但百秋李醇的含量差异较明显，云南广藿香挥发油中为28.53%，广东广藿香挥发油中为42.28%，相差13.75%；以百秋李醇含量为评估指标，广东广藿香挥发油要优于云南广藿香挥发油。通过主成分分析，进一步证实了云南广藿香和广东广藿香挥发油化学成分的差异性。采用RAPD分析筛选出了能够反映不同产地广藿香多态性差异的特异性引物共6个，分别是：OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07，为遗传相关研究奠定了基础，为广藿香的可持续开发提供了应用基础。