油后免膜直播棉苗期病害发生及病原分析

李彩红，刘冰蕾，李 飞，梅正鼎，郭莉莉，何叔军，张志刚，赵瑞元

(湖南省棉花科学研究所，湖南常德 415101)

0 引 言

【研究意义】近年来棉花生产轻简化及绿色化成为洞庭湖棉区的发展趋势，免膜直播逐渐成为一种新的生产模式。但洞庭湖棉区5～6月连续阴雨天气较多，直播后往往引起棉花苗期病害大面积发生，每年都有因烂种、烂芽、死苗导致大面积补种、毁种和重播,苗期病害亦可间接诱发中后期病害及铃病的发生，严重影响棉花的优质高产[1]。研究油后免膜直播棉苗期病害发生的气候影响因子及致病原，对于针对性防控棉花苗期病害具有重要意义。【前人研究进展】棉花苗期病害是一种复合性病害，在我国通常认为其发病类型主要有立枯病、炭疽病、疫病、褐斑病、猝倒病、红腐病等[2-8]，各棉区因气象因素、土壤质地及地势、种植模式的影响，苗期病害种类及致病菌各有不同。目前对于苗期病害大多数为概括性报道且年限较早，普遍认为长江流域棉区苗床上主要为炭疽病[9]。【本研究切入点】随着湖南免膜直播模式的逐步推广，有必要对油后直播棉的主要气候影响因子及引起苗期病害发生的病原种类进行鉴定。研究油后免膜直播棉苗期病害发生及病原分析。【拟解决的关键问题】结合气象资料分析苗期病害发生与气候因子的关系，研究苗期病害大发生流行的气象条件；同时从致病菌入手，通过病原种类鉴定，分析湖南免膜直播棉田引发苗期病害发生的病原种类。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试品种：湘K25，由湖南省棉花科学研究所育种二组提供。

自动气象站：型号PH，购自武汉新普惠科技有限公司。

马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉24 g，水1 000 mL，pH值自然。将马铃薯洗净后去皮，称量200 g切碎，加水适量煮沸20～30 min，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后加水补足1 000 mL，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20 min。

Czapek液体培养基：硝酸钠2 g、氯化钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、磷酸氢二钾1 g、蔗糖30 g，加水定容至1 000 mL，pH调整至7.0，然后分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 苗期病害发生调查

试验地设在湖南省棉花科学研究所常德鼎城科研基地，试验地前茬为油菜，土质为粘土，土地平整，田间管理条件一致。小区随机排列，行长10 m，2行区，3次重复。人工开沟直播，每小区定量播种200粒，开始出苗后每2～3 d调查1 次死苗数和出苗数，至不再有棉苗死亡时调查结束。2016 年播种时间为5 月11 日，2019年为5月22日。试验期间日平均气温及日降水量数据来自试验地自动气象站。

1.2.2 病原菌分离与纯化

于苗期病害发生期采集发病严重的病苗，采用常规组织分离法分离病原菌。具体方法：于超净工作台中，用无菌剪刀剪取病斑与病健交界处的茎叶，放入75%乙醇中浸泡3～5 s后，置于次氯酸钠中浸泡50 s，接着用无菌水清洗3次，剪成3 mm的小块。将小块部位接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养。待菌丝长出后，按稀释平板法获取单孢菌株，并于超低温冰箱保存。

1.2.3 病原菌鉴定

1.2.3.1 培养特性

将所得病原菌在PDA 培养基上25℃恒温倒置培养7 d 后，观察菌落形态、菌丝生长及孢子形态等。

1.2.3.2 分子生物学鉴定

将分离得到的病原菌在PDA 培养基上25℃恒温倒置培养7 d 后收集菌丝，采用CTAB法提取菌株的DNA。以通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')进行聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR)扩增。引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

PCR 反应体系为：10×Taqbuffer2.5 μL(Mg2+pLus)，dNTP Mixture 2 μL，引物ITS4和ITS5各1 μL，模板1 μL，TaqDNA PoLymerase 1U ，ddH2O补足至25 μL。

PCR 反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性50 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的大小和有无，将PCR 扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司测序。

1.3 数据处理

数据统计采用Microsoft office Excel 2010；测序的拼接结果在NCBI 上进行BLAST 比对，根据比对结果，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 苗期病害发生

研究表明，2016年5月11日棉花播种后，于5月15日出现第1次降雨(9.3 mm)，5月23日开始有死苗出现，平均死苗数为1.3，5月25日和5月31日呈现2次死苗高峰，平均死苗数分别为4.0和5.3，期间日均温分布在17.2～28.3℃，降雨总量为183.8 mm。2019年湖南上半年低温阴雨天气持续不断，油菜收获较往年偏晚，棉花5月22日播种，5月25日出现第1次降雨(6.2 mm)，6月3日出现第1次死苗，死苗数为30，为本年度死苗最高峰，6月10日出现第2次死苗小高峰，死苗数为9.7，试验期间日平均气温分布在21.1～28.3℃，降雨总量为251.6 mm，2019年棉花直播后，日均气温高于2016年，但降水量大，空气湿度大，土壤湿度较大，苗期病害发生较2016年偏重。表1

表1 试验地日降雨量、日均温及死苗情况Table 1 Dailyprecipitation，mean temperature and seedling diseases in test fields

2.2 病原菌

采集病株分离纯化，共得到53个菌株。通用引物ITS4/ITS5 PCR扩增得到大小约550 bp的rDNA-ITS基因片段，将测序得到的基因序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析，同时结合形态学观察，分离到的53个菌株被鉴定为镰刀菌属、链格孢属、曲霉属、丝核菌属和附球菌属等共5类。其中，T9、M1、M52、M53等21株属于镰刀菌属，占分离到菌株总数的39.6%，链格孢属菌株17株，包括T5、M9等，占总株数的32.1%，曲霉属11株，如M17等，占总株数的20.7%，丝核菌属如M1～15和附球菌属分别为3株和1株，占分离菌株的5.7%和1.9%。图1

图1 部分菌落形态及菌丝、孢子形态Fig.1 Culture characteristics of some strains

M53、M52与登录号GU724513.1 (Fusariumoxysporum)一致性为99.81%，与登录号KX196807.1 (Fusariumoxysporum)一致性为100%；T9与登录号GU724513.1 (Fusariumoxysporum)和登录号KX196807.1 (Fusariumoxysporum)一致性均为99.62%；M2、M31、M1～15与登录号FJ746938.1(Rhizoctoniasolani)一致性分为99.28%、98.71%、99.86%，与登录号 KJ866423.1(Rhizoctoniasolani)一致性分为99.28%、98.71%、99.86%。图2

图2 部分菌株的18S rDNA 系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees of partial strains based on 18S rDNA

3 讨 论

引发苗期病害的因素主要包括棉苗本身的抗病性、气候条件和菌源[9]。棉花苗期为营养生长期，影响棉苗生长的主要环境因素有温度、降水和光照，春季低温多雨，尤其4～5月寒潮来袭，田间湿度大，会加重苗期病害的发生[10-13]。油后免膜直播模式为油菜收货后播种棉花，播种时间通常在5月10日以后，此时已到春末夏初，气温较高，有利于棉苗生长，降水量成为影响该模式下棉花苗期病害发生的最重要因子之一，播种后水量多，空气和土壤湿度较大，就会使棉花苗期病害严重发生。研究探讨了降雨量与苗期病害发生的关系，即出苗后20 d内是棉苗易受病原菌侵染的时期，病害主要在距播种后第1次降雨1周左右的时间开始发生，持续20 d左右，且大降雨后1周为发病高峰期，应特别做好苗期病害的防控工作，如可通过播前种子包衣、喷施植物诱导免疫剂等措施减轻病害的发生。

我国长江流域棉区春季多雨，病苗率高达90%，以根腐为主的死苗率达20%～30%，根据以往调查，长江流域棉区主要为营养钵育苗移栽方式，苗期病害以炭疽病发生最为普遍，立枯病和红腐病次之[9]。关于油后免膜直播方式下的苗期病害病原发生尚未开展相关研究工作。研究分离获得53个菌株，分属于镰刀菌属、链格孢属、曲霉属、丝核菌属和附球菌属等。镰刀菌是一类重要的土传病原真菌，其中尖孢镰刀菌可侵染棉苗引发枯萎病；串珠镰刀菌、木贼镰刀菌等可引起棉苗红腐病；立枯丝核菌可诱发棉苗立枯病；链格孢菌可导致棉苗黑斑病[14-19]。关于曲霉菌，赵丽红等报道在棉花种子带菌检测中发现了黄曲霉[20]，曲霉属真菌亦可引起棉铃曲霉病，但关于曲霉和附球菌对棉苗的影响未见相关报道，尚需对其作用进一步研究。

4 结 论

降水量为影响油后免膜直播模式下棉花苗期病害发生的最重要因子之一，病害发生主要在距播种后第1次降雨后1周左右的时间开始，且大降雨后1周为发病高峰期，做好苗期病害的防控工作。

分离到的病原菌中以镰刀菌属、链格孢属和曲霉属为主，其次为丝核菌属和附球菌属。