血清蛋白组学对高脂血症性胰腺炎患者治疗前后的差异性分析

邱嘉华 李俊达（通讯作者） 黄敏 陈一婧 葛安琪

（深圳市龙华区人民医院消化内科 广东 深圳 518109）

高脂血症已成为急性胰腺炎的主要病因之一，且高脂血症性胰腺炎（HLP）发病率随着人们生活习惯和饮食结构的改变呈现上升趋势[1]。与其他病因相比，HLP 具有发病年龄较轻、易复发的特点。但临床上对HLP 的相关发病机制及诊治认识不足，确切的发病机制尚不完全清楚。相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）是一种可以寻找差异表达蛋白和分析蛋白功能的技术，广泛应用于蛋白质组学定量研究中[2]。本文旨在采用iTRAQ 与二维液相色谱质谱（2DLC-MS/MS）联用技术对HLP 患者治疗前后进行血清差异蛋白质组学研究，为寻找HLP 新的治疗途径开辟新思路。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年6 月—2019 年5 月我院收治的高脂血症性急性胰腺炎患者30 例，所有入选患者符合诊断标准：中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组修定的《中国急性胰腺炎诊治指南（2019年，沈阳）》[3]，同时血甘油三酯（TG）≥11.30mmoL/L，或TG 5.65～11.3mmol/L，且血清呈乳糜状。排除标准：伴有心血管疾病、机械性肠梗阻、消化性溃疡并穿孔、胆管梗阻患者、长期饮酒者和其它原因引起的急性胰腺炎等患者。所有入组者均知情，通过医院伦理委员会审批。

1.2 主要试剂及仪器

iTRAQ 试剂盒、胰酶（Promega）、三乙基碳酸氢铵缓冲液TEAB、TCEP、MMTS、蛋白浓度检测试剂盒、真空干燥仪冷冻离心机、分光光度计、恒温箱、液相色谱仪、质谱仪Q Exactive、ProteinPilot 4.0 软件等。

1.3 实验方法

1.3.1样本采集、分组 所有入组病例均于治疗前（入院时）、治疗后7 天分别抽取患者空腹静脉血5ml，静置1h，3000r/min离心10min 后取上清液，分装入EP 管中，编号后贮存于-80℃超低温冰箱待检。共收集HLP 治疗前组30 例，均分为3 组，分别为HLP 治疗前1 组、HLP 治疗前2 组、HLP 治疗前3 组（每组10 例）；HLP 治疗后组30 例，均分为3 组，分别为HLP 治疗后1 组、HLP 治疗后2 组、HLP 治疗后3 组（每组10 例）。

1.3.2 蛋白质提取、定量 首先使用去高丰度蛋白试剂盒去除血清样本中的高丰度蛋白后，进行蛋白提取，并用 Bradford法测定蛋白浓度（根据试剂盒说明书进行操作）。

1.3.3 蛋白酶解、iTRAQ 标记 取200ug 蛋白用胰酶消化至肽段水平，从冰箱中取出iTRAQ 试剂盒，平衡到室温，按照手册对样品进行iTRAQ 标记。将HLP 治疗前1 组、HLP 治疗前2组、HLP 治疗前3 组分别标记为：iTRAQ 113、iTRAQ 115、iTRAQ 117；将HLP 治疗后1 组、HLP 治疗后2 组、HLP 治疗后3 组分别标记为：iTRAQ 114、iTRAQ 116、iTRAQ 118。3 个HLP 治疗前组和3 个HLP 治疗后组之间进行3 组重复试验，减少实验误差。混合标记后的样品，真空冷冻离心干燥，抽干后的样品冷冻保存待用。

1.3.4 高PH 液 相 分 级 流 动 相A：H2O（NH3in H2O PH=10）；流动相B：80%ACN （NH3in H2O PH=10）。梯度洗脱条件：0 ～5min，5%B；5 ～10min，5%～10%B；10 ～60min，10%～40%B；60 ～65min，40%～95%B；65 ～75min，保 持95%B；75min ～85min，95%-5%B。真空冷冻离心干燥，抽干后的样品冷冻保存待用。

1.3.5 纳升级反相色谱-质谱分析（nano-RPLC） 将高PH反相分离得到组分后，每管样本用流动相A（2%ACN+0.1%FA）复溶。涡旋震荡，12000prm，4℃离心20min，吸取上清，采用夹心上样，Loading Pump 流速3ul/min，上样10min，分离流速0.3ul/min，分离时间为60min。样本经nano 高效液相色谱分离后转移到质谱仪Q Exactive 进行分析。一级质谱分辨率70000，扫描范围350 ～1800m/z；二级质谱分辨率17500。

1.4 数据分析及生物信息学分析

采用ProteinPilot4.5 软件进行搜库鉴定及定量分析，设置蛋白鉴定置信度为95%，且至少有一个肽段和库中的肽段95%以上相匹配，同时进行蛋白反库检索，设置假阳性率（FDR）＜1%。选取差异倍数≥1.2 为上调蛋白，差异倍数≤0.83 为下调蛋白，所得结果进入分析。通过Uniprot 数据库筛选相关蛋白并进行分析。

1.5 统计学方法

2.结果

2.1 一般情况

30 例入组HLP 住院患者，男性19 例，女性11 例，年龄26～61 岁；平均（40.9±10.7）岁；30 例入组患者入院时（治疗前）进行BISAP 评分[4]，平均（1.53±1.04）分；治疗7 天后进行第二次评分，平均（0.4±0.62）分，评分显著降低（P ＜0.05），所有患者均病情明显好转后出院。

2.2 质谱鉴定结果

共鉴定出蛋白质367 种，基于筛查和鉴定差异蛋白质的条件：选取差异倍数≥1.2 为上调蛋白，差异倍数≤0.83 为下调蛋白，并且P ＜0.05，与HLP 治疗前组比较，HLP 治疗后组发现显著差异蛋白共有91 个，其中上调78 个，下调13 个，见表1。

表1 高脂血症性胰腺炎患者治疗前后血清差异蛋白列表

3.讨论

HLP 的严重程度和并发症发生率更高，其发生发展是多种因素共同参与、共同作用的复杂的病理生理过程。研究HLP 的发病机制，对于提高HLP 的治疗效果具有重要意义。蛋白质是各种生物活动的执行者，绝大部分疾病的病理状态和治疗效应均可体现在蛋白质水平上。通过对HLP治疗前后血清蛋白质组学的研究，筛选和鉴定显著差异蛋白质，有望寻找出新的治疗靶点，提高临床疗效。本实验结果共筛选出显著性差异的蛋白91 个，其中差异最为明显的蛋白质有：MASP2、CLUS 和SAA1。

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2（MASP2）是补体凝集素途径关键酶，以酶原形式存在，是天然免疫系统中的重要组分，有激活补体、促进调理吞噬、调节炎症反应及促进凋亡等功能[5]。MASP2 血清浓度在不同疾病及同一疾病不同阶段不尽相同，与感染性疾病以及自身免疫性疾病的发生发展密切相关。本结果发现HPL 患者治疗后血清MASP2 水平上调，推测与机体启动补体系统、抵御感染有关。

聚集素（CLUS）是一种多功能的糖蛋白复合体，作为对损伤等应激反应的应答而在多种组织中表达，是一种新发现的凋亡抑制因子。研究发现在急性胰腺炎时CLUS 具有抗腺泡细胞凋亡的作用，从而减轻胰酶、炎症因子释放所导致的炎症反应，同时提高CLUS 的表达可能有利于促进胰腺细胞的再生和修复，阻止病情的进展[6,7]。这和本次发现的HLP 患者治疗后血清CLUS上调的结果一致，将为开辟一条新的治疗途径提供线索。

血清淀粉样蛋白A1(SAAl)是一种急性期反应蛋白，参与了机体炎症反应的发生与发展。当炎症、组织损伤等激发时，IL-1、IL-6 等促炎因子调控肝细胞分泌大量SAA1[8]。SAAl 还是一种载脂蛋白，可代替载脂蛋白Al 作为高密度脂蛋白胆固醇的主要载脂蛋白，尤其在急性炎症反应时，SAA1 在高密度脂蛋白胆固醇的转运过程中起主要作用[9]。近年来，相关研究发现过表达SAA 蛋白的肿瘤患者预后不佳[10]。故发现HLP 患者治疗后血清SAA1 下调，可能成为治疗效果或预后随访的指标。

本文筛选出了一系列HLP 相关的血清差异蛋白，这些蛋白可能为研究提高HLP 治疗效果提供线索，但需要进一步深入研究。