人工皮肤模型在皮肤刺激性实验分类中的应用研究

2020-10-26 06:37吴熙陈宁秦美蓉王晓炜王平
健康大视野 2020年19期
关键词:光密度刺激性化学品

吴熙 陈宁 秦美蓉 王晓炜 王平

【中图分类号】R89

【文献标志码】B

【文章编号】1005-0019(2020)19-218-02

欧洲替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的创立是以保护动物在试验和其他科学研究方面的使用为目的,发展审批有助于缩减、优化、替代(Reduce,Refine,Replace,3Rs)动物试验的替代方法[1]。EpiSkinTM测试方法作为一种全新的皮肤刺激性试验在2007年通过欧盟替代方法验证中心的验证(EURL ECVAM)并被OECD指导原则收录。EpiSkinTM是对人天然皮肤的模拟,即将分离的人表皮细胞接种在特定的生物材料上进行培养, 以形成具有三维结构的人表皮样皮肤模型,并具备以下特征:(1)组织学上具备人表皮样结构, 即有基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层, 且角质层具有基本的脂质结构。(2)功能上角质层脂质结构产生的屏障作用能够在一定程度上抵挡有害物质对下层活性细胞的毒性作用。

本实验采用EpiSkinTM 3D人工皮肤模型,按照欧盟OECD 439推荐使用的4种用于皮肤模型刺激性测试的化学品,同时遵循OECD 439的实验流程进行皮肤模型的化妆品刺激性测试,并根据其判断标准来预测化学品对于皮肤的刺激性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 EpiSkinTM 皮肤模型(上海斯安肤诺生物科技有限公司) EpiSkinTM 皮肤模型以正常人的角质形成细胞为种子细胞,在体外发育成复层化结构的表皮模型。在组织学结构上与人皮肤结构高度相似,含有角质层、颗粒层、棘层和基底层,见图1。

1.1.2 试剂 噻唑蓝(MTT)(Sigma,美国)、异丙醇(上海凌峰化学试剂有限公司)、含钙镁的磷酸盐缓冲液(DPBS)(Gibco,美国)、磷酸盐缓冲液(PBS)(Gibco,美国)、维持培养基(上海斯安肤诺生物科技有限公司)、测试培养基(上海斯安肤诺生物科技有限公司)。

1.1.3 受试物 硬脂酸甲酯、1-甲基-3-苯基哌嗪、庚醛、兔耳草醛,十二烷基磺酸钠(SDS)均购自Sigma公司,均为化学纯试剂。

1.1.4 仪器设备 细胞培养箱、通风柜、振荡器、酶标仪、电子天平、超纯水机、专用打孔器、四通道计时器。

1.2 方法

1.2.1 实验依据及原理 该实验方法依据国际经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南439[2]的规定进行。基本原理是刺激性化学物质作用于皮肤模型引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(简称MTT) 法检测细胞活性来判断化学物的皮肤刺激性。

1.2.2 质量控制 EpiSkinTM3D人工皮肤模型(中国生产)是来源于中国人角质形成细胞的重建人类表皮模型,通过检测确保不携带HIV、乙肝和丙肝病毒、细菌和支原体。

基于质量控制的指标,EpiSkinTM3D人工皮肤模型可用于正式皮肤刺激性测试。对于每一种化学品,需要3轮不同批次的皮肤模型来对其进行皮肤刺激性的测试。

1.2.3 实验前准备

(1)在无菌培养板中加入维持培养基,用镊子将组织移至新的培养板中。将培养板放置在37℃通有5%CO2的培养箱中培养24h。

(2)在培养板孔中加入0.3mg/mL的MTT溶液,将待测样品(10μL或10mg)分别加入孔中,将载有MTT溶液和待测样品的培养板放在37℃通有5%CO2的培养箱中培养3h。如果MTT溶液颜色变成蓝色或紫色,说明待测样品与MTT反应,在之后的刺激性测试中需使用死皮对照以去掉非特异性光密度值。

1.2.4 分组 实验设阴性对照和阳性对照。PBS为阴性对照组,5%SDS为阳性对照组,硬脂酸甲酯、1-甲基-3-苯基哌嗪、庚醛、兔耳草醛为受试物组。

1.2.5 加样量 液体样品每孔10μL。固体样品每孔(10±2)mg,并加入5μL蒸馏水,使其溶解。

1.2.6 实验步骤

(1)化学品10 μL(固体10 mg研成粉末,同时加蒸馏水5 μL)局部接触面积约0.37 cm2的皮肤模型表面15 min;(2)阴性对照加10 μL PBS、阳性对照加10 μL 5%SDS;(3)与化学品接触15 min后用25 mL PBS冲洗活性皮肤,浸入2.0 mL维持培养基内。1-3步需在通风安全柜中进行;(4)继续在饱和湿度、5% CO2、37 ℃的条件下孵育42 h;(5)浸入2.0 mL浓度0.3 mg/mL的MTT溶液(用测试培养基配制)内,在饱和湿度、5% CO2、37 ℃孵育3 h;(6)MTT反应完的皮肤模型,浸入500 μL酸化异丙醇的离心管内,混匀,在室温、避光的条件下过夜;(7)振荡混合仪混匀每个离心管,每管中取200 μL标本加入96孔板中,在570 nm处用酶标仪读取光密度值,以酸化异丙醇溶液作为空白对照。按照下列公式,将所得光密度值换算为组织细胞存活率,用组织细胞存活率来判断化学品是否具有刺激性,阴性对照的平均光密度值相当于100%的细胞存活率。

细胞存活率(%)=(受试物光密度值/阴性对照组光密度值)×100%

1.2.7 结果判定

根据受试物三轮试验测试的细胞存活率计算平均值得到该受试物的组织细胞存活率,按表1判定标准进行刺激等级判定。

1.2.8 系统成立的条件 须同时满足以下三个条件:

(1)阴性对照平均光密度值介于0.6-1.5之间,SD(%)≤18;

(2)阳性对照平均细胞存活率≤40%,SD(%)≤18;

(3)受试物的细胞存活率是通过三轮独立的实验(即3个不同批次)获得的平均值,每轮实验每个受试物设3个皮肤模型单位进行评价,同批次模型受试物的评价等级需一致。

2 结果

4 种化学品的细胞存活率见表1。

根据本研究实验结果,对所测试的4种化学品与欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的化学品分类标准测试结果进行比较(这4种化学品分类标准是依据兔皮肤实验体内测试),同时也与欧盟认可皮肤模型EpiSkin在欧洲的体外测试结果比较,结果见表2。

在4种化学品中,ECVAM体内测试分类数据表明刺激性化学品为3种,本实验皮肤模型能正确分类3种;非刺激性化学品为1种,本实验能正确分类1种,准确率达到100%。

3 讨论

本实验选择的4种化合物各自具有典型的特点,物理状态包括液态和固态。液态化合物中庚醛为易挥发物质,而EpiSkinTM人工皮肤模型加样量仅为10 μL,并且需涂抹20 s,环境温度和净化操作台的风向可能对实验结果影响较大,所以其数值结果较大。兔耳草醛可以与MTT相互作用影響实验结果,因此需使用死皮对照以去掉非特异性光密度值。本实验选择3种刺激性化合物和1种非刺激性化合物,实验结果与ECVAM体内测试分类数据一致,EpiSkinTM人工皮肤模型可以评估化学品的皮肤刺激性。

动物实验在研究疾病、开发检测医药和疫苗、评价化学物质的危险性等诸多方面,有着不可或缺的重要作用。随着各国有关动物福利法律的完善,寻找替代动物实验的科学方法得到了各国政府和科学工作者的关注。许多发达国家广泛开展了体外替代方法的研究和验证工作,已涉及到皮肤刺激和腐蚀性实验、眼刺激和腐蚀性实验、光毒性实验、皮肤致敏性实验以及热原检验等[4-6]。EpiSkinTM人工皮肤模型已经过多个国家的实验室验证,并被收录在OECD指导原则中,是国际上认可的模型。

参考文献

[1] Balls M. ECVAM and the promotion of international cooperation in the development, validation and acceptance of replacement alternative test methods[J]. Altex, 1996, 16: 280-282.

[2] OECD. Guideline for testing of chemicals, No. 439: in vitro skin irritation: reconstructed human epidermis test method [S]. Paris: OECD, 2010.

[3] Carine Tornier, Martin Rosdy, Howard I. Maibach. In vitro skin irritation testing on reconstituted human epidermis: Reproducibility for 50 chemicals tested with two protocols [J]. Toxicology in Vitro 20 (2006) 401–416.

[4] Liebsch M, Spielmann H. Currently available in vitro methods used in the regulatory toxicology [J]. Toxicol Lett, 2002, 127(1-3): 127-134.

[5] Portes P, Pygmalion M J, Popovic E, et al.Use of human reconstituted epidermis Episkin for assessment of weak phototoxic potential of chemical compounds [J]. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 2002, 18(2): 96-102.

[6] Jirova D, Kejlova K, Brabec M, et al. The benefits of the 3T3 NRU test in the safety assessment of cosmetics: long-term experience from pre-marketing testing in the Czech Republic [J].Toxicol in vitro, 2003, 17(5-6): 791-796.

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